[發明專利]一種粗糙脈胞菌外切葡聚糖酶突變菌株的構建方法和應用

在審

• 申請號: 201910238620.1
• 申請日: 2019-03-27
• 公開（公告）號: CN109837232A
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發明（設計）人: 韓曉云;王曦冉;孫慶申;鄭桂華;李珊珊
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/56;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 岳泉清

1.一種粗糙脈胞菌外切葡聚糖酶突變菌株的構建方法，其特征在于它是按照以下步驟進行的：

一、cbh-1基因獲得

設計引物對，以粗糙脈孢菌的基因序列為模板，進行PCR擴增，對PCR產物進行凝膠電泳，并膠回收目的基因片段；

引物1 5'-ttcatCGATGAATTCATGCTCGCCAAGTTCGCTGC-3'；

引物2 5'-GGCAAGCTGATCCCCCTCATACGGTGGATGTATTGCC-3'；

二、無縫克隆構建載體

對載體進行酶切，得到線性化載體；將步驟一獲得的目的基因片段與線性化載體連接，獲得無縫克隆構建載體；

三、將步驟二得到的無縫克隆構建載體，轉化到大腸桿菌感受態細胞內，驗證目的基因成功轉入大腸桿菌感受態細胞內后，即完成所述的粗糙脈胞菌外切葡聚糖酶突變菌株的構建。

2.根據權利要求1所述的一種粗糙脈胞菌外切葡聚糖酶突變菌株的構建方法，其特征在于步驟一中PCR擴增的PCR體系如下：

PCR擴增條件：98℃預變性5min；98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，25個循環，最后72℃延伸5min。

3.根據權利要求1所述的一種粗糙脈胞菌外切葡聚糖酶突變菌株的構建方法，其特征在于步驟二所述的對載體進行酶切是Sma Ⅰ和EcoR Ⅰ進行雙酶切，所述的載體為qa-5myc.6His載體；

雙酶切體系為：

酶切條件：37℃酶切2小時。

4.根據權利要求1所述的一種粗糙脈胞菌外切葡聚糖酶突變菌株的構建方法，其特征在于步驟二的連接體系為：

連接條件：37℃連接30min。

5.根據權利要求1所述的一種粗糙脈胞菌外切葡聚糖酶突變菌株的構建方法，其特征在于驗證目的基因成功轉入大腸桿菌感受態細胞內的方法為：

將已經轉化無縫克隆構建載體到大腸桿菌感受態細胞進行擴增，對擴增后的大腸桿菌感受態細胞進行質粒DNA提取，對提取的質粒DNA進行酶切驗證：

酶切體系為：

酶切條件：37℃酶切20min。

6.如權利要求1所構建的一種粗糙脈胞菌外切葡聚糖酶突變菌株的應用，其特征在于它與牛糞混合后共同發酵玉米芯。

7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于粗糙脈胞菌外切葡聚糖酶突變菌株與牛糞混合后共同發酵玉米芯是按照以下內容進行的：

一、發酵料配制：按質量百分含量稱取玉米芯75％、牛糞15％、石膏1％、石灰1％、尿素0.4％和麩皮7.6％，加水攪拌至無游離水；

將配制后的發酵料置于37℃培養箱中培養2天后，再于57℃培養三天；培養期間每間隔36小時進行翻堆和補水，得到發酵料；

二、按6％的接種量將粗糙脈胞菌外切葡聚糖酶突變菌株接入到步驟一的發酵料中，并加水攪拌至無游離水；置于37℃培養箱中培養2天后，再于57℃培養三天；培養期間每間隔36小時進行翻堆和補水，即完成發酵玉米芯的過程。