[發(fā)明專利]基于焦磷酸測序法的Septin9基因甲基化檢測的引物和試劑盒

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• 申請日: 2019-03-27
• 公開（公告）號: CN109825588A
• 公開（公告）日: 2019-05-31
• 發(fā)明（設計）人: 王淑一;吳鵬飛
• 申請（專利權）人: 南昌艾迪康醫(yī)學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 杭州千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 黎雙華

本發(fā)明公開了檢測Septin9基因CpG島的CG甲基化的引物、方法和試劑盒，所述引物包括從樣本核酸中擴增Septin9基因CpG島上與腸癌有關的5個CG位點的DNA片段的特異性引物和對獲得的核酸片段進行焦磷酸測序的引物。通過本發(fā)明的引物、方法和試劑盒，采用焦磷酸測序技術，可檢測出與大腸癌易感腫瘤相關的Septin9基因甲基化的頻率，從而篩查出早期大腸癌易感人群，特異性好，準確度高，而且能高通量檢測樣本。

技術領域

本發(fā)明屬生命科學和生物技術領域，特別涉及用于Septin9基因甲基化位點檢測的方法、引物和試劑盒，采用焦磷酸測序技術，能對Septin9基因甲基化頻率進行檢測，特異性好，準確度高，而且可以進行高通量篩查甲基化樣本。

背景技術

Septin9基因位于染色體17q25.3，septin家族是一組高度保守的GTP結合蛋白，廣泛存在于人類細胞，在細胞分裂中提供結構支撐。在人體當中，總共有13個Septin基因，相應編碼15種多肽。所有Septin可以形成異聚復合物并參與高級結構的組成，在肌動蛋白動力學、血管生成、細胞生成、細胞運動、細胞增殖、細胞形狀、細胞質分裂、微管調節(jié)，囊泡靶向與胞吐作用方面均有重要的生理作用。目前認為，septins形成穩(wěn)定的六聚體或八聚體，六聚體包含2分子Septin2、Septin6和Septin7，而八聚體包含兩分子Septin9。研究表明，Septin9占據(jù)了八聚體終端的位置，對亞基聚合起關鍵作用，并穩(wěn)定整個多聚體，在子細胞的胞質分裂過程的最后階段至關重要。Septin9在Septin多聚體中的關鍵作用可能是Septin9超甲基化及轉錄受到抑制時引起癌變的關鍵因素。

研究表明，Septin9與多種癌癥發(fā)生有明顯關系，包括乳腺癌、結直腸癌、卵巢癌、頭頸部癌癥、白血病和淋巴瘤。然而結直腸癌中Septin9基因異常甲基化的檢出率要遠高于其它癌癥，Grutzmann等對Septin9基因在各種腫瘤及非腫瘤疾病患者血漿的甲基化水平進行了系統(tǒng)研究，結果顯示，結直腸癌患者血漿Septin9甲基化的檢出率(72％，90/125)遠高于非結直腸癌的其他癌癥患者(11.5％，11/96)、非癌癥疾病患者(13％，41/315)及正常人(10％，19/183)。這一結果說明血漿中Septin9甲基化對結直腸癌有較高的靈敏度和特異性，與其他癌癥、非癌癥疾病和正常人有顯著性的差異。Septin9_V2轉錄本的啟動子區(qū)域DNA甲基化是CRC癌變的標志，隨著疾病從腺瘤進展到不典型增生再到癌，組織中Septin9mRNA的表達進行性減少，CRC組織中Septin9的表達量顯著低于健康組。而研究表明，在結腸腺瘤和癌組織中，Septin9_V2轉錄本的甲基化模式的重大變化只限于一個CpG島，即CGI3。在Septin9CGI3核心區(qū)，這種獨特的甲基化模式可能代表甲基化狀態(tài)的過渡，并在細胞水平反應結腸粘膜中惡性腫瘤的進展。CGI3的超甲基化可以抑制Septin9_V2的正常表達，進而擾亂結構蛋白的形成和關鍵細胞功能。