[發明專利]基于焦磷酸測序法的Septin9基因甲基化檢測的引物和試劑盒

在審

• 申請號: 201910238397.0
• 申請日: 2019-03-27
• 公開（公告）號: CN109825588A
• 公開（公告）日: 2019-05-31
• 發明（設計）人: 王淑一;吳鵬飛
• 申請（專利權）人: 南昌艾迪康醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 杭州千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 黎雙華

1.用于檢測Septin9基因CpG島甲基化的引物，所述引物包括從樣本核酸中擴增Septin9基因片段的特異性引物和對獲得的核酸片段進行焦磷酸測序的引物，其特征在于，從樣本核酸中擴增Septin9基因片段的特異性引物堿基序列為：

Septin9-F:GYGGTTAGTTTTGTATTGTAGGAG

Septin9-R:Biotin-TCCRAAATAATCCCATCCAAC

對所獲得的核酸擴增產物進行焦磷酸測序的引物堿基序列為：

Septin9-S:GATTTGTTGTTTATTAGTTATTATG。

2.如權利要求1所述的引物，其特征在于，引物Septin9-R的5'端被生物素標記。

3.一種用于檢測Septin9基因CpG島甲基化的方法，包括：

(1)提取樣本中的DNA；

(2)將提純的DNA進行亞硫酸氫鹽處理；

(3)以步驟(2)中的DNA作為模板，使用引物Septin9-F和Septin9-R擴增Septin9基因片段，獲得PCR擴增產物；引物序列如下：

Septin9-F:GYGGTTAGTTTTGTATTGTAGGAG

Septin9-R:Biotin-TCCRAAATAATCCCATCCAAC；

(4)取步驟(3)中的PCR擴增產物進行瓊脂糖電泳，檢測是否擴增成功；

(5)若步驟(4)中擴增成功，則進行單鏈純化；

(6)利用焦磷酸測序引物對步驟(5)中的單鏈純化產物進行測序；焦磷酸測序引物序列如下：

Septin9-S:GATTTGTTGTTTATTAGTTATTATG；

(7)根據步驟(6)中的焦磷酸測序結果，得到每個CG位點的甲基化頻率。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(3)擴增的反應條件為94℃2分鐘；98℃10秒，60℃20秒，68℃20秒，35個循環；68℃5分鐘。

5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(5)單鏈純化的具體步驟為：將得到的50ul PCR產物與3ul鏈親和素包被的磁珠及47ul結合緩沖液混合，室溫孵育10～15min，期間震蕩2～3次，然后使用Vaccuum prep tool吸取磁珠，將帶有磁珠的Vaccuumprep tool先后放進70％(V/V)乙醇、變性液、1×Wash Buffer中清洗10s左右，再將Vaccuumprep tool放入含有49ul退火緩沖液及1ul焦磷酸測序引物的96孔板中，釋放磁珠，將該96孔板放置于80℃2min，再冷卻至室溫，即得到測序反應所需的單鏈純化產物。

6.用于檢測Septin9基因CpG島甲基化的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括核酸提取試劑、亞硫酸氫鹽處理試劑，PCR擴增體系、PCR產物的單鏈純化試劑，焦磷酸測序試劑，所述PCR擴增體系包括用于擴增基因Septin9 CpG島DNA片段的特異性引物，其堿基序列為：

Septin9-F:GYGGTTAGTTTTGTATTGTAGGAG

Septin9-R:Biotin-TCCRAAATAATCCCATCCAAC

所述焦磷酸測序試劑包括對所獲得的核酸擴增片段進行焦磷酸測序的引物，其堿基序列為：

Septin9-S:GATTTGTTGTTTATTAGTTATTATG。

7.如權利要求6所述的試劑盒，引物Septin9-R5'端被生物素標記。

8.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述核酸提取試劑包括糞便懸浮液；所述PCR擴增體系還包括2*Buffer、dNTP、KOD酶和純水。

9.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述亞硫酸氫鹽處理試劑包括10mM氫醌溶液(Hydryquinone)和3.6mol/LNaHSO₃。

10.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，；所述單鏈純化試劑包括鏈親和素包被的磁珠、70％(V/V)乙醇、變性液、1×Wash Buffer、結合緩沖液、退火緩沖液；所述測序試劑包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、底物APS、熒光素及dNTP。