[發(fā)明專利]疫霉菌P.hydropathica的LAMP檢測(cè)引物、檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910236404.3
• 申請(qǐng)日: 2019-03-26
• 公開（公告）號(hào): CN109897911B
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張晨;熊琴;錢雨琳;鄭新月;李雪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 南京申云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

本發(fā)明公開了一種疫霉菌P.hydropathica的LAMP檢測(cè)引物、檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。該LAMP檢測(cè)引物由正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向環(huán)引物L(fēng)B組成；檢測(cè)試劑盒包括LAMP檢測(cè)引物、LAMP反應(yīng)液。本發(fā)明根據(jù)疫霉菌P.hydropathica的翻譯延伸因子EF?TU序列設(shè)計(jì)引物，采用LAMP技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，特異性強(qiáng)、靈敏度高，具有快速、準(zhǔn)確性高、現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用方便等優(yōu)點(diǎn)，解決了現(xiàn)有疫霉菌P.hydropathica檢測(cè)技術(shù)中存在的周期長(zhǎng)、靈敏度低、成本高、現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用困難等缺陷，對(duì)疫霉菌P.hydropathica檢疫鑒定、監(jiān)測(cè)和減少對(duì)農(nóng)藥盲目使用方面具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害檢測(cè)、鑒定及防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種疫霉菌Phytophthora hydropathica的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)引物、檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，可用于疫霉菌 P.hydropathica的快速、靈敏和特異的分子檢測(cè)，同時(shí)可用于疫霉菌P.hydropathica的早期診斷和病菌的檢測(cè)和鑒定。

背景技術(shù)

疫霉菌Phytophthora hydropathica屬于卵菌門(Oomycota)、卵菌綱(Oomycetes)、霜霉目 (Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉屬(Phytophthora)。疫霉屬中許多種都是植物病原菌，引起的病害對(duì)許多喬灌木、農(nóng)作物和花卉植物造成了毀滅性危害，在中國(guó)由于疫霉菌引起的疫病損失以及疫霉種群的復(fù)雜性逐年都在增加，嚴(yán)重威脅人類正常生產(chǎn)生活。疫霉菌P. hydropathica作為病原菌寄主范圍廣，危害性強(qiáng)，可以侵染杜鵑花、山月桂、黃瓜、赤楊木、繡球等植物。2017年本課題組首次在胭脂樹上分離出這種病原菌，隨后該種病原菌在廣東、云南省多個(gè)城市被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。為了阻止P.hydropathica傳播范圍的不斷擴(kuò)大，防止該疫病的大面積爆發(fā)，使其引起的疫病得到控制，開發(fā)快速靈敏的檢疫鑒定疫霉菌P.hydropathica的技術(shù)迫在眉睫。

目前疫霉菌P.hydropathica的特定的檢測(cè)鑒定方法少見于文獻(xiàn)或其它資料。一般而言，疫霉菌Phytophthora spp.的分類鑒定和檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)方法兩大類，傳統(tǒng)方法主要是基于形態(tài)學(xué)特征、致病性測(cè)定、生理生化特征等性狀。傳統(tǒng)方法在疫霉菌的檢測(cè)鑒定中發(fā)揮了重要作用，但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且要求操作者具備專業(yè)的疫霉菌分離、形態(tài)學(xué)鑒定知識(shí)和豐富的經(jīng)驗(yàn)；同時(shí)傳統(tǒng)分類鑒定方法耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、易受人為及環(huán)境等諸多因素的干擾，不能在病害潛伏期和發(fā)病初期做出診斷，很難對(duì)病害發(fā)生進(jìn)行及時(shí)的監(jiān)測(cè)和有效控制；特別是診斷一些致病癥狀及形態(tài)特征極其相似而難以區(qū)分的病原菌，給傳統(tǒng)的鑒定方法更帶來了巨大的挑戰(zhàn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子檢測(cè)方法得到了迅速的發(fā)展和應(yīng)用，如常規(guī)PCR、巢式PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR等，這類方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏且不需要進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)的特點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛使用于鑒定和定量分析各類病毒、細(xì)菌、真菌和卵菌病原微生物。然而，該方法檢測(cè)時(shí)間仍然比較長(zhǎng)，之后的電泳跑膠費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且需要依賴精密且價(jià)值較高的PCR儀，不能滿足快速檢測(cè)的需求。