[發明專利]一種熱穩性提高的融合型脂肪酶及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201910235250.6
• 申請日: 2019-03-27
• 公開（公告）號: CN109776686B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 黃遵錫;姜占寶;苗華彪;韓楠玉
• 申請（專利權）人: 云南師范大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N9/20;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;A23K20/189
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 苗艷榮

1.一種熱穩性提高的融合型脂肪酶，其特征在于，所述的融合型脂肪酶由梳棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶在N端融合雙親短肽構成，所述的雙親短肽由30～32個氨基酸組成，所述的雙親短肽為雙親短肽1或雙親短肽2，其氨基酸序列分別為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

所述的融合型脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

2.編碼權利要求1所述的融合型脂肪酶的DNA分子。

3.根據權利要求2所述的DNA分子，其特征在于，所述的DNA分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.7所示。

4.權利要求1所述的融合型脂肪酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)設計引物F1和R1、F2和R2進行無模板PCR，從而獲得雙親短肽1、雙親短肽2；再設計引物F3和R3、F3和R4分別將雙親短肽1、雙親短肽2進行PCR擴增；

2)以梳棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶基因連接到載體上的重組質粒為模板，設計引物F4和R5、F5和R5分別進行PCR擴增脂肪酶1、脂肪酶2；

3)以F3、R5為引物，分別以雙親短肽1與脂肪酶1、雙親短肽2與脂肪酶2為模版進行融合PCR擴增；

4)將融合PCR擴增產物與載體進行重組；

5)將5μL重組產物于50μLDH5α感受態細胞中，經冰浴冷卻、熱激，冷卻后，加500μLLB培養基，37℃180轉培養1h，離心保留部分清液懸浮沉淀，取全部菌液涂板，37℃過夜培養；

6)進行陽性克隆子篩選驗證，挑取單菌落于相應抗性的LB培養基中，培養2-3h后PCR鑒定，將篩選出的陽性克隆子測序。

5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，F1、R1、F2、R2、F3、R3、F4、R4、F5、R5的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.8～17所示。

6.一種工程菌，其特征在于，所述的工程菌含有具有SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示基因的載體。

7.根據權利要求6所述的工程菌，其特征在于，所述的載體選自pPIC9K、pPIC9、pPICZaA\B\C、pPICZA\B\C或PGAPZaA\B\C。

8.權利要求1所述的融合型脂肪酶在飼料添加劑中的應用。