[發明專利]一種基于PEDV N蛋白特異性納米抗體的阻斷ELISA的檢測方法及其應用

有效

• 申請號: 201910233889.0
• 申請日: 2019-03-26
• 公開（公告）號: CN110016078B
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 肖書奇;馬志倩;王天宇;田陽升;李爽
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N15/13;C12N15/70;G01N33/569
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

本發明公開了一種基于PEDV N蛋白特異性納米抗體的阻斷ELISA的檢測方法及其應用，本發明以PEDV N蛋白包被酶標板，納米抗體BioNb2為阻斷抗體，通過待檢血清樣品抑制納米抗體BioNb2與PEDV N蛋白結合，以檢測血清中豬流行性腹瀉病毒特異性抗體；本發明的阻斷ELISA方法能夠排除抗原中的雜蛋白成分的干擾而具有良好的特異性，且操作簡單，易于大范圍推廣，在豬流行性腹瀉病毒的血清診斷方面具有良好的應用前景；本發明通過大量的實驗優化阻斷ELISA反應條件，使該方法用于豬流行性腹瀉病毒抗體檢測具有良好的重復性、特異性和靈敏性，與目前已有的商品化試劑盒相比，具有簡便、快速、成本低廉等優勢。

技術領域

本發明涉及免疫工程技術領域，更具體的說是涉及一種基于PEDV N蛋白特異性納米抗體的阻斷ELISA的檢測方法及其應用。

背景技術

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種豬易感的急性高度接觸性傳染性腸道疾病，其主要特征為嚴重的水樣腹瀉、嘔吐、脫水、少食或不食、哺乳仔豬死亡率為100％。該病是目前危害養殖業最嚴重的疾病之一，每年給全球養豬業帶來巨大的經濟損失。PEDV能夠感染各個年齡段的豬，成年豬主要表現為體重下降和營養不良等，但對一周齡以內的哺乳仔豬是致死性。該病于1791年首次發生于英國并在歐洲流行。我國是1973年首次在上海豬群檢測到該病毒，隨后一直以散在形式發生，直到2010年10月，PEDV高毒力變異毒株的出現并迅速傳遍全國，引起PED在中國的全面爆發，導致100多萬頭哺乳仔豬的死亡，給中國養豬業帶來幾乎毀滅性的打擊。PEDV屬于冠狀病毒科的冠狀病毒屬(Coronavirus)成員，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，PEDV的基因組長度約為28kb，編碼至少7個開放閱讀框，包括非結構蛋白(ORF1a、ORF1b和ORF3)和結構蛋白(核衣殼蛋白(N)，膜蛋白(M)，糖基化纖突蛋白(S)和包膜蛋白(E)。其中，PEDV N蛋白是一種與病毒復制、轉錄和組裝相關的磷酸化的蛋白，在宿主免疫中具有重要的作用。已有研究報道，在PEDV感染早期，宿主能夠產生高水平的抗N蛋白的抗體。此外，N蛋白高度保守，因此被認為是早期診斷和疫苗研發的靶蛋白之一。

過去幾十年以來，大量檢測PEDV的方法被報道。由于PED引起的臨床癥狀與其他腹瀉疾病的臨床癥狀相似，比如傳染性胃腸炎病，因此需要借助分子生物學和免疫學方法診斷該疾病。傳統的PEDV診斷方法都是基于實驗室檢測的，包括病毒分離試驗、反轉錄-聚合酶鏈式反應試驗、間接免疫熒光試驗和酶聯免疫吸附試驗。然而，這些傳統的方法耗時、昂貴，低特異性和低靈敏性且需要專業的設備及專業的操作人員。此外，樣品間的交叉污染和運輸延誤都有可能造成結果判斷不準確等問題。間接ELISA和競爭或阻斷ELISA已被廣泛應用于PEDV臨床樣品的檢測，但這些方法是建立在PEDV特異性單克隆抗體或多克隆抗體的基礎上的，具有費用昂貴、耗時、產量低和不穩定性等缺點。

抗體介導的免疫檢測方法因其方便靈敏而被廣泛應用。納米抗體是一種天然缺失輕鏈和重鏈第一個恒定區的特殊IgG，它存在于駱駝科動物體內。與傳統抗體的抗原結合片段不同，納米抗體的抗原結合片段由一個單獨的結構域構成，即重鏈抗體可變區(variabledomains of Camellidae heavy chain-only antibodies，VHH)，VHH分子量較小，約15kDa左右，是已知的最小的具有完整抗原結合功能的抗體片段。與傳統的抗體相比，納米抗體具有穩定性高，可溶性好、結合抗原能力強、親和力強、免疫原性小和能在細菌體內大量表達等特點。因此，基于PEDV N蛋白特異性納米抗體建立一種快速、靈敏、準確和低成本的診斷方法為臨床監測宿主體內的抗體水平提供有力的工具，從而為養豬業的健康發展保駕護航，是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容