[發明專利]肝豆狀核變性斑馬魚模型的建立方法

有效

• 申請號: 201910233705.0
• 申請日: 2019-03-26
• 公開（公告）號: CN109880827B
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 羋肖肖;嚴健;施軍平
• 申請（專利權）人: 杭州師范大學附屬醫院（杭州市第二人民醫院）
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 昆明合眾智信知識產權事務所 53113
• 代理人: 錢磊

本發明公開了肝豆狀核變性斑馬魚模型的建立方法，包括下列步驟：將gRNA靶點序列設計在斑馬魚ATP7B基因外顯子2編碼的氨基酸結構域上，合成引物；以pMD19?gata5_gRNA scaffold載體為模板，使用引物制備gRNA體外轉錄模板進行體外轉錄、純化回收獲得gRNA；將gRNA和Cas9 mRNA注射入單細胞期斑馬魚胚胎，培養篩選從而獲得ATP7B突變斑馬魚，本發明用于模擬肝豆狀核變性疾病特征。

技術領域

本發明涉及模式動物疾病模型的構建方法技術領域，尤其涉及肝豆狀核變性斑馬魚模型的建立方法。

背景技術

肝豆狀核變性(又稱Wilson disease，OMIM#277900)是由于銅離子過量蓄積在肝細胞造成肝細胞損傷，過多的銅離子經肝細胞流出后通過血腦屏障進入大腦，沉積在豆狀核部位繼而造成了該部位損傷。該疾病的全球發病率約為1/30,000，亞洲人群的發病率高于歐美人群，東亞地區可達1/10,000。肝豆狀核變性的臨床表現以肝病和神經精神癥狀為主，少數患者出現內分泌和血液系統疾病。肝臟異常首先表現為脂肪變，隨后可進展為急性肝功能衰竭、肝炎和肝纖維化。同時基底神經節和腦干是銅蓄積損傷另一易發部位，肝豆狀核變性患者最為明顯的神經癥狀為帕金森樣運動缺陷和癲癇。因此如何有效治療肝豆狀核變性具有非常重要的現實意義。

銅離子代謝失衡是肝豆狀核變性疾病的特征表現。正常情況下，人體從飲食中獲得銅離子，經小腸吸收后通過門脈循環進入肝臟。肝臟是維持銅離子穩態的中心場所。ATP7B是一種金屬轉運P型三磷酸腺苷(ATP)酶，研究表明ATP7B基因突變導致該蛋白功能降低或缺失，銅離子不能經高爾基體運送到肝細胞膜周圍，從而阻止了銅離子與血漿銅藍蛋白的結合以及經膽汁的排泄，導致銅在肝細胞堆積。肝臟是機體銅過量最主要的受累器官，研究表明，在肝豆狀核變性患者的臨床表現中，100％患者有肝病癥狀，40-50％患者有神經癥狀，20％患者有其它器官的異常。盡管經過多年的研究，目前關于銅過量如何誘導多樣臨床表現還不是完全清晰。

Dong等對中國漢族632例肝豆狀核變性患者進行ATP7B基因Sanger測序分析，發現90％(569/632)病人帶有兩種或兩種以上有害變異。截止到目前為止，已報道的肝豆狀核變性患者ATP7B基因變異種類達800多種。然而，肝豆狀核變性的疾病表型與ATP7B基因型卻不是簡單的對應關系。Ferenci等對1357例患者臨床表型分析，發現ATP7B基因型與患者的臨床表型不相關。通過多因素回歸分析發現，PNPLA3G等位基因(rs738409)而不是ATP7B基因型或者肝銅含量，是患者中/重度肝臟脂肪變(33％ofhepatocytes)的獨立危險因素。肝豆狀核變性相關的肝硬化患者相對于HBV相關的肝硬化患者有更高的脾腫大風險(oddsratio＝4.15,95％confidence interval:1.38-12.45,P＝0.011)。

肝豆狀核變性的疾病進程伴隨著大量銅離子由細胞質進入細胞核，由此開啟了細胞轉錄組重塑。Hamilton等發現激活LXR/RXR信號通路后，在肝臟銅積累沒變情況下，仍可改善ATP7B^-/-小鼠肝臟脂質代謝癥狀。通過體外實驗發現，抑制p38和c-Jun信號通路，可恢復由溫和類型ATP7B突變(即H1069Q)導致的肝細胞銅穩態失衡。ATP7B不僅表達在肝細胞，還表達在非實質細胞，研究表明，肝細胞特異性敲除ATP7B僅導致肝臟脂肪變而沒有炎癥發生。由此，我們認為在肝豆狀核變性發生過程中，ATP7B突變導致的銅累積是起因，過多的銅離子進入細胞核后開啟轉錄組的重塑是肝豆狀核變性多樣的臨床表型的直接原因。

目前研究者關于銅穩態失衡導致肝豆狀核變性發生的下游分子機制探索仍處于起步階段，而現有驅銅治療藥物的不確定性與隱患迫切需要借助多樣的動物模型來探索銅穩態失衡導致肝豆狀核變性發生的分子調控機理。本研究利用CRISPR/Cas9系統構建ATP7B斑馬魚系，通過對突變體銅蓄積情況、銅敏感性、肝臟病理等分析描述突變魚系的發病情況。

發明內容

本發明提供肝豆狀核變性斑馬魚模型的建立方法。