[發明專利]肝豆狀核變性斑馬魚模型的建立方法

有效

• 申請號: 201910233705.0
• 申請日: 2019-03-26
• 公開（公告）號: CN109880827B
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 羋肖肖;嚴健;施軍平
• 申請（專利權）人: 杭州師范大學附屬醫院（杭州市第二人民醫院）
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 昆明合眾智信知識產權事務所 53113
• 代理人: 錢磊

1.肝豆狀核變性斑馬魚模型的建立方法，其特征在于，包括下列步驟：

S1、將gRNA靶點序列設計在斑馬魚ATP7B基因外顯子2編碼的氨基酸結構域上，sgRNA具體序列為5’- GAGACGGTTAAAGGGTTCC-3’ ，合成引物；

S2、以pMD19-gata5_gRNA scaffold載體為模板，使用步驟S1中的引物制備gRNA體外轉錄模板；

S3、將步驟S2的gRNA體外轉錄模板進行體外轉錄、純化回收獲得gRNA；

S4、將步驟S3回收獲得gRNA和Cas9 mRNA新鮮混合后顯微注射入單細胞期斑馬魚胚胎，每個靶點注射180～220枚；

S5、收集步驟S4注射入單細胞期斑馬魚胚胎完成48小時后的斑馬魚胚胎，提取基因組，PCR擴增目標片段，測序，測序結果為雙峰的注射批次胚胎進入飼養系統，飼養待性成熟時通過篩選其下一代胚胎檢測有效突變類型斑馬魚，從而獲得ATP7B突變斑馬魚；

S6、取步驟S5的ATP7B突變斑馬魚進行ATP7B表達量檢測；

S7、取步驟S5的ATP7B突變斑馬魚，分別對開始進食5天和進食45天的ATP7B突變斑馬魚進行銅含量分析；

S8、取步驟S5的ATP7B突變斑馬魚進行成魚形體分析；

S9、取步驟S5的ATP7B突變斑馬魚6天大的幼魚進行銅蓄分析，所述銅蓄分析包括明場顯微鏡觀察狀況與ICP-MS定量銅含量；

S10、取步驟S5的ATP7B突變斑馬魚6天大的幼魚進行銅敏感性濃度依賴分析和病理分析；

S11、通過對步驟S6、步驟S7、步驟S8、步驟S9、步驟S10獲得數據進行分析描述ATP7B突變斑馬魚的發病情況。

2.如權利要求1所述的肝豆狀核變性斑馬魚模型的建立方法，其特征在于：所述步驟S1中將gRNA靶點序列設計在斑馬魚ATP7B基因外顯子2編碼的氨基酸結構域。

3.如權利要求1所述的肝豆狀核變性斑馬魚模型的建立方法，其特征在于：所述S4中gRNA和Cas9 mRNA新鮮混合后顯微注射入單細胞期斑馬魚胚胎，gRNA為300～600pg,Cas9mRNA為200pg。

4.如權利要求1所述的肝豆狀核變性斑馬魚模型的建立方法，其特征在于，所述步驟S5中測序結果為雙峰的注射批次胚胎進入飼養系統，飼養待性成熟時通過篩選其下一代胚胎檢測有效突變類型斑馬魚。

5.如權利要求1所述的肝豆狀核變性斑馬魚模型的建立方法，其特征在于，所述步驟S9中明場顯微鏡觀察狀況方法：取步驟S5中ATP7B突變斑馬魚剛孵化出的幼魚浸泡到銅溶液中，明場顯微鏡下觀察到斑馬魚突變體肝臟和頭部發黑情況。

6.如權利要求1所述的肝豆狀核變性斑馬魚模型的建立方法，其特征在于，所述步驟S9中ICP-MS定量銅含量的方法：取1000條取步驟S5中5天大的ATP7B突變斑馬魚幼魚或5條取步驟S5中45天大的ATP7B突變斑馬魚青年魚，加入HClO₄于180℃消化10小時，后轉入120℃搖動使殘留酸揮發，用Milli-Q高純水稀釋，用ICP-MS測量各組織銅含量。

7.如權利要求1所述的肝豆狀核變性斑馬魚模型的建立方法，其特征在于：所述步驟S10中銅敏感性濃度依賴分析為采用不同濃度硫酸銅溶液浸泡ATP7B突變斑馬魚，明場顯微鏡觀察突變體在含銅溶液中表現的身體側翻、扭曲表型并進行統計分析。