[發(fā)明專利]弓形蟲α淀粉酶基因敲除蟲株的構(gòu)建方法及用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910230221.0
• 申請日: 2019-03-26
• 公開（公告）號: CN110042117B
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 方瑞;楊靜;徐東梅;李森陽;趙俊龍;申邦;周艷琴
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/90;C12N15/56;A61K39/002;A61P33/02
• 代理公司: 武漢開元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 徐紹新

本發(fā)明公開了一種弓形蟲基因敲除蟲株的構(gòu)建方法，該方法敲除了弓形蟲α淀粉酶基因，所述α淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述弓形蟲基因敲除蟲株在α淀粉酶位點(diǎn)具有如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。該基因敲除蟲株具有毒力小，在動物體內(nèi)繁殖少等優(yōu)點(diǎn)，能提高動物對弓形蟲的免疫能力，有成為抗弓形蟲基因工程疫苗的潛力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種弓形蟲α淀粉酶(簡稱AMY)基因敲除蟲株的構(gòu)建方法，以及使用該方法構(gòu)建的α淀粉酶基因缺失蟲株的用途，屬于生物及基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

弓形蟲是一種能夠引起世界性的人畜共患病的原蟲，從屬于頂復(fù)動物門，是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，具有很強(qiáng)的入侵能力，能夠感染幾乎所有溫血動物。據(jù)估計，世界上超過三分之一的人口已經(jīng)暴露在這種寄生蟲之下，并已被該蟲潛伏感染。在南美和歐洲一些地區(qū)，人群和動物的感染率高達(dá)80-90％；在中國，感染率一般在10％左右。弓形蟲是一種非常重要的機(jī)會性致病原蟲，在人類中，免疫功能正常的宿主感染后多呈無癥狀帶蟲狀態(tài)，而在免疫功能受損或先天感染者，常存在很大風(fēng)險，嚴(yán)重時可致死。孕婦感染弓形蟲可引起流產(chǎn)、胎兒畸形、死胎，免疫缺陷和免疫抑制病。鑒于其危害的嚴(yán)重性，弓形蟲已被列為孕婦常規(guī)檢查中的一個必檢項(xiàng)目。弓形蟲能在人、畜和野生動物之間廣泛傳播，對人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅，弓形蟲感染重要農(nóng)業(yè)動物會產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì)損失，同時能通過食物傳播給人類。隨著城市犬、貓的數(shù)量增多，人們飲食習(xí)慣及行為方式的改變，以及有機(jī)農(nóng)業(yè)的興起，目前弓形蟲感染率正呈上升的趨勢。

因此，弓形蟲病的防控對于人類健康和畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展均有重要意義。然而，到目前為止，弓形蟲病的預(yù)防沒有良好的疫苗，因而構(gòu)建具有良好免疫原性和免疫保護(hù)力的弓形蟲疫苗具有重要價值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種弓形蟲α淀粉酶基因敲除蟲株的構(gòu)建方法，該蟲株由于敲除了α淀粉酶基因，具有毒力小，在動物體內(nèi)繁殖少等優(yōu)點(diǎn)，能提高動物對弓形蟲的免疫能力，有制備抗弓形蟲基因工程疫苗的潛力。

(1)本發(fā)明所述弓形蟲基因敲除蟲株(簡稱△AMY蟲株)的構(gòu)建：構(gòu)建pSAG1-Cas9-TgU6-sgAMY質(zhì)粒、制備α-amy-5UTR::DHFR::α-amy-3UTR同源模板,共電轉(zhuǎn)至出發(fā)蟲株ME49，經(jīng)1uM乙胺嘧啶篩選、PCR鑒定獲得弓形蟲基因敲除蟲株△AMY；

(2)進(jìn)行了基因敲除蟲株△AMY毒力試驗(yàn)：以野生型蟲株ME49為對照,腹腔接種7周齡雌性ICR小鼠，1×10²個速殖子/小鼠，每組接10只，記錄30天內(nèi)小鼠的存活情況。結(jié)果表明感染△AMY敲除株的小鼠30天內(nèi)存活率90％。

(3)不同劑量的△AMY蟲株對小鼠的毒力試驗(yàn)：腹腔接種7周齡雌性ICR小鼠，1×10²，1×10³，和1×10⁴個敲除株蟲子，每組接10只，對照組接1×10²個ME49速殖子/小鼠，記錄30天內(nèi)小鼠的存活情況。結(jié)果表明接種1×10²敲除株實(shí)驗(yàn)組小鼠30天之內(nèi)沒有死亡，1×10³敲除株30天之內(nèi)小鼠存活率80％，1×10⁴敲除株30天之內(nèi)小鼠存活率50％，對照組小鼠存活率20％。說明弓形蟲AMY基因敲除之后對小鼠的毒力下降明顯。

(4)小鼠感染△AMY蟲株后的荷蟲量試驗(yàn)：對7周齡雌性ICR小鼠腹腔接種1×10⁵個敲除株和野生型蟲株速殖子，感染后7天，收取小鼠腹水，進(jìn)行定量qPCR，分析腹水荷蟲量。結(jié)果表明接種△AMY敲除蟲株小鼠腹水荷蟲量顯著低于野生型ME49的對照組小鼠腹水荷蟲量，說明弓形蟲△AMY在小鼠體內(nèi)無明顯繁殖，可以被宿主有效清除。