[發(fā)明專(zhuān)利]弓形蟲(chóng)α淀粉酶基因敲除蟲(chóng)株的構(gòu)建方法及用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910230221.0
• 申請(qǐng)日: 2019-03-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110042117B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-07-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方瑞;楊靜;徐東梅;李森陽(yáng);趙俊龍;申邦;周艷琴
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/79
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/79;C12N15/90;C12N15/56;A61K39/002;A61P33/02
• 代理公司: 武漢開(kāi)元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 徐紹新

1.一種弓形蟲(chóng)α淀粉酶基因敲除蟲(chóng)株的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)出發(fā)蟲(chóng)株是具有α淀粉酶基因的弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株，所述α淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示；

(2)pSAG1-Cas9-TgU6-sgAMY質(zhì)粒的構(gòu)建：利用軟件設(shè)計(jì)弓形蟲(chóng)α淀粉酶基因的打靶位點(diǎn)，根據(jù)所設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)gRNA上、下游引物，然后以pSAG1-Cas9-TgU6-sgUPRT質(zhì)粒為模板，利用所設(shè)計(jì)的引物及Q5點(diǎn)突變?cè)噭┖羞M(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行KLD酶連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)提取后得到pSAG1-Cas9-TgU6-sgAMY質(zhì)粒，其中，上、下游引物序列分別為：

gRNA-AMY-F：5’-GTCCCAGGGCATGCTATGGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’

gRNA-R：5’–AACTTGACATCCCCATTTAC–3’；

(3)α-amy-5UTR::DHFR::α-amy-3UTR同源模板的制備：以出發(fā)蟲(chóng)株的基因組為模板，設(shè)計(jì)引物，分別擴(kuò)增α-amy-5UTR和α-amy-3UTR同源臂，以pUC19質(zhì)粒及含DHFR質(zhì)粒為模板分別擴(kuò)增pUC19載體、DHFR藥物篩選標(biāo)簽，連接上述4個(gè)片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19-α-amy-5UTR::DHFR::α-amy-3UTR，該質(zhì)粒即α淀粉酶基因的敲除質(zhì)粒，利用α-amy-5UTR-F、α-amy-3UTR-R引物擴(kuò)增上述基因敲除質(zhì)粒即獲得α-amy-5UTR::DHFR::α-amy-3UTR同源模板，其中，擴(kuò)增α-amy-5UTR和α-amy-3UTR同源臂所用的上、下游引物序列分別為：

U5α-amy-F：5’-GTTGTAAAACGACGGCCAGTAAGCGCCAGAGGTCGCAGTT-3’

U5α-amy-R：5’-GATGTCTTCTGCGCGGGTTGGTTCCAGAAGTTCTGCGTC-3’

U3α-amy-F：5’-GCCACAAGTTCAGCGTGTCCAGAAAGTTCTTTTCAAGTCTC-3’

U3α-amy-R：5’-GCTATGACCATGATTACGCCGGTGTACAAGAGGAACATGA-3’

(4)弓形蟲(chóng)基因敲除蟲(chóng)株的獲得：將步驟(2)中的pSAG1-Cas9-TgU6-sg AMY質(zhì)粒和步驟(3)中的α-amy-5UTR::DHFR::α-amy-3UTR同源模板共電轉(zhuǎn)至步驟(1)中所述出發(fā)蟲(chóng)株，通過(guò)1uM乙胺嘧啶篩選，PCR鑒定，獲得α淀粉酶基因敲除蟲(chóng)株，所述基因敲除蟲(chóng)株缺失SEQ IDNO：1所示核苷酸序列。

2.弓形蟲(chóng)α淀粉酶基因敲除蟲(chóng)株在制備抗弓形蟲(chóng)基因工程活疫苗中的用途，所述弓形蟲(chóng)α淀粉酶基因敲除蟲(chóng)株是按照權(quán)利要求1所述的方法構(gòu)建的。