[發明專利]一種金槍魚骨膠原多肽的制備方法

在審

• 申請號: 201910225417.0
• 申請日: 2019-03-25
• 公開（公告）號: CN109762864A
• 公開（公告）日: 2019-05-17
• 發明（設計）人: 武益正;雷芬芬;侯杰;胡傳榮;徐慶菊;何東平;王新新;張四紅
• 申請（專利權）人: 泰安市海之潤食品有限公司;武漢輕工大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K14/78;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 常州市權航專利代理有限公司 32280
• 代理人: 陳萍

1.一種金槍魚骨膠原多肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一、金槍魚骨蛋白的制備；

步驟二、將所述金槍魚骨蛋白與蒸餾水混勻，并進行加熱加壓處理，得到金槍魚骨蛋白漿液；

步驟三、調節所述金槍魚骨蛋白漿液pH，并加入木瓜蛋白酶進行酶解，待酶解反應結束，得到酶解液；

步驟四、將所述酶解液在沸水浴中滅酶8～15分鐘，得到滅酶酶解液；

步驟五、將所述滅酶酶解液靜置冷卻，離心取上清液后再進行超濾處理，即得膠原多肽粗液；

步驟六、將膠原多肽粗液加入到陰離子交換樹脂層析柱中，依次用雙蒸水、NaCl溶液洗脫，得到離子交換層析物；

步驟七、將離子交換層析物溶于雙蒸水中配成離子交換層析物溶液，將其離心取上清液后再加入到葡聚糖凝膠柱層析中，再用雙蒸水進行洗脫，得到凝膠層析物；

步驟八、將所述凝膠層析物溶于雙蒸水中配成凝膠層析物溶液，再采用高效液相色譜對其進行純化處理，即得金槍魚骨膠原多肽。

2.如權利要求1所述金槍魚骨膠原多肽的制備方法，其特征在于，所述步驟一中金槍魚骨蛋白的制備過程如下：將金槍魚下腳料去頭、尾、鰭，取其魚肉骨架切段，并將其與中性蛋白酶溶液按料液比1:5～10混合，在溫度為45～65℃，pH為7.5的條件下進行酶解脫肉2～3小時，得到金槍魚骨架，所述金槍魚骨架上的碎肉與所述金槍魚骨架的質量比小于1:1000,再將所述金槍魚骨架放入0.1mol/L NaOH溶液中攪拌20～30小時以除去雜蛋白，再用清水將其洗至中性，再置于100g/L、pH為7.2的乙二胺四乙酸二鈉中，并在溫度為3～5℃下攪拌脫鈣處理4～6天，待金槍魚骨架呈透明狀時將其洗凈，再用1mol/L的鹽酸處理16～20小時，即得到柔軟有韌性的金槍魚骨蛋白。

3.如權利要求1所述的金槍魚骨膠原多肽的制備方法，其特征在于，所述步驟二中：第一階段，將金槍魚骨蛋白與蒸餾水按料液比1：6～10混勻，并加熱至75～80℃，在壓力0.02～0.04Mpa下保溫處理5～10分鐘；第二階段，以10～15℃/min的速度繼續加熱至85～90℃，在壓力0.07～0.08Mpa下保溫處理10～15分鐘；第三階段，以5～10℃/min的速度繼續加熱至100℃，以100℃的高溫蒸汽繼續保溫處理15～20分鐘，得到金槍魚骨蛋白漿液。

4.如權利要求1所述的金槍魚骨膠原多肽的制備方法，其特征在于，所述步驟三中調節所述金槍魚骨蛋白漿液的pH至7～9，并加入木瓜蛋白酶進行酶解，酶解反應溫度為55～65℃，酶解反應時間為4～5小時，待酶解反應結束，得到酶解液。

5.如權利要求4所述的金槍魚骨膠原多肽的制備方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶的加酶量為金槍魚骨蛋白漿液用量的1～2ug/g。

6.如權利要求1所述的金槍魚骨膠原多肽的制備方法，其特征在于，所述步驟五中將滅酶酶解液靜置冷卻25～35分鐘，溫度降至40～50℃，離心取上清液后再進行超濾處理，即得膠原多肽粗液。

7.如權利要求6所述的金槍魚骨膠原多肽的制備方法，其特征在于，所述步驟五中超濾處理采用超濾膜的孔徑為20～30納米，超濾溫度為30～40℃，超濾壓力為0.35～0.45MPa，超濾時間為20～30分鐘。

8.如權利要求1所述的金槍魚骨膠原多肽的制備方法，其特征在于，所述步驟六中將膠原多肽粗液加入到二乙氨基乙醇-52陰離子交換樹脂層析柱中，再依次用雙蒸水，0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L的NaCl溶液洗脫，得到離子交換層析物。

9.如權利要求1所述的金槍魚骨膠原多肽的制備方法，其特征在于，所述步驟七中將離子交換層析物溶于雙蒸水中配成濃度為10mg/mL的離子交換層析物溶液，將其離心取上清液后再加入到葡聚糖凝膠柱層析中，再用雙蒸水進行洗脫，設置進樣量為2.0～2.4mL，流速為0.6～1.0mL/min，根據280nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，得到凝膠層析物。

10.如權利要求1所述的金槍魚骨膠原多肽的制備方法，其特征在于，所述步驟八中將所述凝膠層析物溶于雙蒸水中配成濃度為70μg/mL的凝膠層析物溶液，再采用高效液相色譜對其進行純化處理，即得金槍魚骨膠原多肽；

其中，純化處理時設置進樣量為4～8μL，柱溫為25～30℃，流動相為15％乙腈溶液，所述乙腈溶液中含有0.04～0.06％的三氟乙酸和0.002～0.004％的薄荷醇，洗脫速度為0.8mL/min，高效液相色譜分離填料為改性介孔硅膠，所述改性介孔硅膠中2-巰基-1-甲基咪唑和2-巰基-5-甲基-1,3,4-噻二唑的偶聯密度分別為100μmol/g和20μmol/g。