[發明專利]用于研究應激顆粒的斑馬魚模型的構建方法及其用途

有效

• 申請號: 201910224062.3
• 申請日: 2019-03-22
• 公開（公告）號: CN109897827B
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發明（設計）人: 徐進;王瑞琪;張賀飛;杜久林
• 申請（專利權）人: 中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/65;C12N15/85;A01K67/027;G01N33/68
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 華珊;徐迅

本發明涉及用于研究應激顆粒的斑馬魚模型的構建方法及其用途。具體地，本發明建立了一種用于實時觀測SG形成及變化的的可視化在體模型，所述模型是在所述細胞的基因組中的內源性的應激顆粒相關基因(如G3BP1基因)內或編碼區兩端且讀框不變地插入熒光基因的斑馬魚模型。本發明的斑馬魚在體工具將可以把對SG的研究提升到在體模型中，用于研究各類行為、刺激或生理變化對應激顆粒形成的影響，也可以用于活體篩選可以調控應激顆粒形成及變化的藥物。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及用于研究應激顆粒的斑馬魚模型的構建方法及其用途。

背景技術

細胞的應激反應(Stress response)調控是保持細胞活力和功能修復中的重要因素。對神經衰老和神經退行性疾病發生而言，正常的應激反應尤其重要。細胞應激反應中一個關鍵的環節是應激顆粒(SG，Stress Granule)的動態調控。當細胞面臨各類應激信號，包括病毒侵襲、氧化應激、蛋白異常聚集時，在胞漿中會通過信號轉導，如eIF2蛋白的磷酸化，來抑制mRNA的翻譯系統，并形成由多個RNA結合蛋白為核心的包含顆粒狀蛋白的亞細胞結構--應激顆粒。通過這個應激調控，細胞可以更有效地控制蛋白合成，調劑資源，維持細胞在不利生存條件下的生存。在應激條件解除后，應激顆粒也可以解聚，使細胞恢復正常功能。近幾年的研究提示應激顆粒的動態調控失調是神經退行性疾病，如AD、ALS、前額顳葉癡呆(FTD)等發生中重要的細胞機制。多個和進程最迅速，癥狀最令人恐懼的ALS發生相關的蛋白，如TDP43、FUS、Ataxin2、C9orf72等，都和應激顆粒的動態有密切關系。與AD密切相關的Tau蛋白也和應激顆粒關鍵蛋白TIA1相互作用來調控神經毒性。可以預見應激顆粒動態失調將是一個可以影響多種神經退行性疾病進程的關鍵神經細胞生物學事件。

然而，目前所有關于應激顆粒的研究都是在細胞內表達外源性的帶熒光標記的SG蛋白，如G3BP1，或通過免疫熒光染色來觀察SG的變化，而沒有在體的觀測系統。由于外源性表達G3BP1本身就有可能影響應激顆粒的形成，而且只能用于體外培養的細胞，因此有較大的局限性。

因此，本領域亟需開發一種可用于實時觀測SG形成及變化的在體工具。

發明內容

本發明的目的在于提供一種可用于實時觀測SG形成及變化的在體工具。

具體地，本發明的目的在于提供一種用于研究應激顆粒的斑馬魚模型的構建方法及其用途。

本發明的第一方面，提供了一種制備斑馬魚模型的方法，包括以下步驟：

(a)提供斑馬魚的細胞，在所述細胞的基因組中的內源性的應激顆粒相關基因的編碼區內、編碼區5’端、或編碼區3’端且讀框不變地插入熒光基因，得到可表達具有熒光標記的應激顆粒蛋白的斑馬魚細胞；和

(b)利用步驟(a)中得到的可表達具有熒光標記的應激顆粒蛋白的斑馬魚細胞，制備得到可表達具有熒光標記的應激顆粒蛋白的斑馬魚模型。

在另一優選例中，所述應激顆粒相關基因包括編碼應激顆粒蛋白的基因。

在另一優選例中，所述應激顆粒相關基因包括：G3BP1、TIA1、PABP1、eIF4G、或其組合。

在另一優選例中，所述應激顆粒蛋白包括：G3BP1、TIA1、PABP1、eIF4G、或其組合。

在另一優選例中，所述熒光標記包括熒光蛋白及其變體或衍生物(如光學加亮熒光蛋白)。

在另一優選例中，所述熒光蛋白選自下組：綠色熒光蛋白(GFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、紅色熒光蛋白(RFP)(如mCherry)、藍色熒光蛋白(BFP)、青色熒光蛋白基因(CFP)、橙色熒光蛋白、光激活蛋白(FHP)、光激活綠櫻桃(GPAC)、番茄紅蛋白、光蛋白(例如，水母發光蛋白、螢火蟲螢光素蛋白)、或其組合。