[發明專利]用于研究應激顆粒的斑馬魚模型的構建方法及其用途

有效

• 申請號: 201910224062.3
• 申請日: 2019-03-22
• 公開（公告）號: CN109897827B
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發明（設計）人: 徐進;王瑞琪;張賀飛;杜久林
• 申請（專利權）人: 中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/65;C12N15/85;A01K67/027;G01N33/68
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 華珊;徐迅

1.一種制備斑馬魚模型的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(a)提供斑馬魚的細胞，在所述細胞的基因組中的內源性的應激顆粒相關基因的編碼區內、編碼區5’端、或編碼區3’端且讀框不變地插入熒光基因，得到可表達具有熒光標記的應激顆粒蛋白的斑馬魚細胞；和

(b)利用步驟(a)中得到的可表達具有熒光標記的應激顆粒蛋白的斑馬魚細胞，制備得到可表達具有熒光標記的應激顆粒蛋白的斑馬魚模型；

其中，所述的應激顆粒蛋白為G3BP1；

并且，所述的在編碼區內插入熒光基因是指在編碼應激顆粒蛋白的N端第1-11位氨基酸相對應的核酸序列之間插入熒光基因。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述熒光基因讀框不變地插入在編碼G3BP1蛋白的N端的第10-11位氨基酸相對應的核酸序列之間。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括通過鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄激活樣效應子核酸酶(TALEN)介導的基因組編輯、或CRISPR/Cas系統進行熒光基因的插入。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法通過CRISPR/Cas系統插入熒光基因。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中，還包括如下步驟：

(a1)利用CRISPR基因編輯技術，在所述細胞的基因組中的內源性的G3BP1基因的編碼區內讀框不變地插入熒光基因，得到可表達具有熒光標記的G3BP1蛋白的斑馬魚細胞。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述CRISPR基因編輯技術為CRISPR-Cas9基因編輯技術。

7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(a1)中包括將sgRNA、cas9蛋白和含熒光基因的供體序列的混合物注射至斑馬魚細胞的細胞核中。

8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(a1)中包括將攜帶有sgRNA、cas9蛋白編碼序列和含熒光基因的供體序列的載體轉染到斑馬魚細胞核中。

9.如權利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述sgRNA序列選自下組：

sgRNA1: GACCAAAGAAATGGTGATG (SEQ ID NO: 1)；

sgRNA2: GATGGAGAAGCCAAGTGCC (SEQ ID NO: 2)；

sgRNA3: GTATTACACCCTGCTGAAC (SEQ ID NO: 3)；

sgRNA4: GCCAAGTGCCCAGCTTGTC (SEQ ID NO: 4)；和/或

sgRNA5: GGCTCCTGACTACCTGCAC (SEQ ID NO: 5)。

10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，還包括如下步驟：

(b1)利用步驟(a)中得到的可表達具有熒光標記的G3BP1蛋白的斑馬魚細胞，制備得到嵌合斑馬魚；

(b2)將步驟(b1)中得到的嵌合斑馬魚外交，在后代中篩選獲得可表達具有熒光標記的G3BP1蛋白的斑馬魚模型。

11.一種權利要求1所述方法制備的斑馬魚模型的用途，其特征在于，將所述斑馬魚模型用作研究應激顆粒調控和/或應激顆粒調控相關疾病的動物模型；其中，所述應激顆粒調控相關疾病為神經退行性疾病、癌癥。

12.一種權利要求1所述方法制備的斑馬魚模型的用途，其特征在于，所述模型用于：

(1)篩選或鑒定調控應激顆粒或治療應激顆粒調控相關疾病的藥物，其中，所述應激顆粒調控相關疾病為神經退行性疾病、癌癥；和/或

(2)篩選或鑒定影響應激顆粒調控的環境條件。