[發(fā)明專利]一種快速檢測白細胞毒素的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910219615.6
• 申請日: 2019-03-21
• 公開（公告）號: CN109884210A
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發(fā)明（設計）人: 高冬梅
• 申請（專利權(quán)）人: 楊凌職業(yè)技術學院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/36
• 代理公司: 成都弘毅天承知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51230
• 代理人: 劉東

本發(fā)明公開了一種快速檢測白細胞毒素的方法，包括如下步驟：步驟1：對照樣品的準備：制備白細胞毒素溶液，對白細胞毒素溶液進行分離純化，得到高純度白細胞毒素對照樣品；步驟2：用乙腈將食品樣品溶解，過濾后注入進樣瓶，然后將對照樣品和樣瓶中的食品樣品均進行UPLC?q TOF MS檢測；步驟3：色譜條件：采用ACQUITY?UPLC?BEH C18，2.1×100mm，1.7μm的色譜柱，柱溫：30?50℃，以0.1％甲酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，進行梯度洗脫，梯度洗脫的方式為：0?2min，25％流動相A；2?6min，25?15％流動相A；6?8min，15?10％流動相A；8?8.5min，10?25％流動相A；8.5?10min，25％流動相A；流速0.3mL/min。

技術領域

本發(fā)明涉及食品安全技術領域，具體涉及一種快速檢測白細胞毒素的方法。

背景技術

9，10-環(huán)氧-12-亞油酸(9，10-epoxy-12-linoleic acid)，又名白細胞毒素(Leukotoxin，Ltx)，是由亞油酸通過自動氧化，或者在細胞色素P450(cytochrome P450)的作用下環(huán)氧化而成的一種衍生物。在生物體內(nèi)，Ltx可溶性環(huán)氧化物水解酶(Solubleepoxide hydrolase，sEH)的共同存在可以促成其轉(zhuǎn)化為9，10-二羥基-十八碳烯酸(9，10-dihydroxyoctadecenicacid)，取名為白細胞毒素二醇(Leukotoxin diol，Ltxd)。白細胞毒素二醇為白細胞毒素開環(huán)形成頻哪醇的化合物。大量研究已經(jīng)證實Ltx和Ltxd與燒傷病人多器官功能衰竭、急性呼吸窘迫征、線粒體解偶聯(lián)以及人乳腺癌細胞增殖等眾多現(xiàn)象相關，但這些研究都是基于體外培養(yǎng)、靜脈注射或者自身產(chǎn)生，而對Ltxs及iLtxds的口服急性毒性研究的文獻還比較少見。

近年來，隨著大量Ltxs和Ltxds在食品中的新發(fā)現(xiàn)不斷被提出，它們在加工食品中含量水平如何，以及潛在的毒性危害有多大等問題已引起了廣泛關注。由于白細胞毒素在食品中主要是以三酰甘油形式存在，所以目前國內(nèi)外對白細胞毒素和白細胞毒素二醇的檢測也主要是基于衍生化(皂化、甲酯化)反應，通過GC-MS或GC-FID等技術進行檢測。但是Ltx不能直接進行GC-MS分析，必須經(jīng)過復雜、繁瑣的衍生反應，且衍生化反應需要無水，操作要求較高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于：針對上述Ltx不能直接進行GC-MS分析，必須經(jīng)過復雜、繁瑣的衍生反應，且衍生化反應需要無水的現(xiàn)象導致操作要求較高，檢測方法復雜的問題，本發(fā)明提供一種快速檢測白細胞毒素的方法。

本發(fā)明采用的技術方案如下：

一種快速檢測白細胞毒素的方法，包括如下步驟：

步驟1：對照樣品的準備：制備白細胞毒素溶液，對白細胞毒素溶液進行分離純化，得到高純度白細胞毒素對照樣品，白細胞毒素溶液制備方法為：將重量份為5份的亞油酸，加入到圓底燒瓶中，加入400份干燥二氯甲烷和磁子，并將圓底燒瓶放入裝滿冰的冰槽中。另外將重量份為3份的3-氯過氧苯甲酸，溶于50份干燥二氯甲烷中。將含有3-氯過氧苯甲酸的二氯甲烷溶液通過恒壓分液漏斗緩慢滴加至圓底燒瓶中，滴加時間約持續(xù)3min，并在磁子攪拌下，在冰槽中持續(xù)反應6h，每隔半小時通過薄層層析(TLC)方法檢測進程。待反應完成，加入50份水中斷反應，轉(zhuǎn)入分液漏斗，對反應混合物進行洗滌。將混合物倒入分液漏斗，加入50份10％碳酸氫鈉水溶液，充分震蕩后分去上層。再用4％NaCl水溶液洗一次，最后用純水洗三次，加入無水硫酸鈉干燥過夜，過濾掉無水硫酸鈉后，在旋蒸儀中以36℃水浴減壓蒸干，-20℃冷凍保存；

步驟2：質(zhì)譜條件：Waters Xevo G2q TOF系統(tǒng)，采用ESI離子源負離子模式，分辨模式，用甲酸鈉矯正質(zhì)量軸，用亮氨酸腦啡肽，作為標準物質(zhì)進行實時矯正，氬氣作為碰撞氣體，碰撞梯度1.9，毛細管電壓2.5kV，脫溶劑溫度350-450℃，脫溶劑氣流量500-700L/Hr，離子源溫度100-140℃；