[發(fā)明專利]一種脂肪酶在拆分外消旋2-溴代異戊酸乙酯中的應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2019-03-21
• 公開（公告）號: CN110066835B
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭建永;吳鵬;汪釗;章銀軍;張夢婕
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12P41/00
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發(fā)明提供了一種脂肪酶在拆分2?溴代異戊酸乙酯中的應(yīng)用，所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼基因如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明脂肪酶基因可與表達(dá)載體連接構(gòu)建得到含該基因的胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株中，獲得重組大腸桿菌；該重組大腸桿菌經(jīng)細(xì)胞破碎，分離純化獲得重組脂肪酶；該重組脂肪酶具有催化拆分外消旋2?溴代異戊酸乙酯的能力，可以得到產(chǎn)物(R)?2?溴代異戊酸乙酯，對映體過量值99％和轉(zhuǎn)化率達(dá)到50.8％，產(chǎn)物(R)?2?溴代異戊酸乙酯的質(zhì)量收率達(dá)到96.4％，而且拆分效率高。

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物催化技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種脂肪酶立體選擇性催化水解拆分2-溴代異戊酸乙酯對映體合成單一構(gòu)型的(R)-2-溴代異戊酸乙酯對映體的應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

氟胺氰菊酯是非環(huán)丙烷梭酸類的擬除蟲菊酯，具有和氰戊菊酯相似的結(jié)構(gòu)。它共有四個光學(xué)異構(gòu)體。工業(yè)品是由右旋酸和消旋氰醇組成的一對高效體，具有廣譜的殺蟲活性具觸殺和胃毒作用，還有拒食和驅(qū)避活性。其毒力和氰戊菊酯相當(dāng)能有效地防治棉花、果樹、蔬菜、玉米、茶葉、煙草等作物上包括鱗翅目、鞘翅目、同翅目、和雙翅目、在內(nèi)的主要害蟲。另外它還能防治牲畜害蟲如血紅扁頭蜂、羊鼻蠅角蠅、廄蠅、狗櫛頭蚤等。文獻(xiàn)中多數(shù)用原料D-纈氨酸來合成得到氟胺氰菊酯，D-纈氨酸法雖然可以直接得到手性產(chǎn)物，但價格比較昂貴。而從價格較為低廉的2-溴代異戊酸乙酯來合成氟胺氰菊酯的消旋體，再通過手性拆分來得到工業(yè)品應(yīng)用的高效體，可以降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。然而我們提供了一種脂肪酶來催化水解拆分2-溴代異戊酸乙酯來高效生產(chǎn)(R)-2-溴代異戊酸乙酯的有效方法，可以直接得到手性產(chǎn)物，從而大大降低了成本。

脂肪酶(Lipase,EC 3.1.1.3)全稱為三酰基甘油酰基水解酶(Triacylglycerolacylhydrolase)，是目前研究與工業(yè)化應(yīng)用最多的一類水解酶。脂肪酶能催化酯水解、酯合成、醇解、酸解、酯酯交換和氨解反應(yīng)。脂肪酶廣泛存在于自然界的各種生物體，特別是在微生物和動植物組織中。動物脂肪酶主要存在于胰臟等器官組織，比如豬肝酯酶和豬胰脂肪酶，但由于動物脂肪酶活性較低、酶提取純化成本較高和原料來源有限等因素，限制了其在工業(yè)中的應(yīng)用。微生物脂肪酶來源豐富，種類繁多，不受季節(jié)氣候等因素的影響，微生物生長產(chǎn)酶周期較短，而且具有耐有機(jī)溶劑、底物專一性強(qiáng)、催化選擇性高和催化活性高等特點(diǎn)，因而微生物來源的脂肪酶有較高的工業(yè)化應(yīng)用價值。目前市場上大部分商品化脂肪酶都通過細(xì)菌、真菌和酵母等微生物培養(yǎng)發(fā)酵獲得。丹麥Novo Nordisk公司、日本Amano公司和美國Genencor公司等主要酶制造商開發(fā)了多種的商品化酶制劑。這些酶制劑公司利用分子改造技術(shù)對微生物脂肪酶進(jìn)行改造，提高酶活力、穩(wěn)定性和立體選擇性等酶學(xué)性質(zhì)，以滿足不同工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用的需求。因而構(gòu)建脂肪酶基因工程菌從而大量生產(chǎn)重組脂肪酶具有十分重要意義。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種立體選擇性脂肪酶在生物法拆分2-溴代異戊酸乙酯中的應(yīng)用，可以直接獲得手性產(chǎn)物，大大降低成本。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：