[發明專利]分離免疫細胞的方法及其應用

有效

• 申請號: 201910216336.4
• 申請日: 2019-03-21
• 公開（公告）號: CN109897817B
• 公開（公告）日: 2019-12-13
• 發明（設計）人: 徐智峰;張新
• 申請（專利權）人: 廣州沙艾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 11582 北京久維律師事務所
• 代理人: 邢江峰

本發明公開了一種分離免疫細胞并進一步誘導分化成EPCs的方法，其包括：(1)獲取外周血，吸取單個核細胞層液加于離心管中，數次離心，末次離心后吸盡上清，根據計數結果，用RPMI1640培養液配成所需濃度，約為2×10⁷/ml。(2)培養除未貼壁細胞。(3)使用含10％胎牛血清的RPMI1640培養液，添加M?CSF、IL?3、諸葛菜素D，各培養孔最終體積為1ml，M?CSF、IL?3、諸葛菜素D的終濃度分別為5ng/ml、0.4ng/ml、0.1?0.3ng/ml，每2天添加試劑1次，對貼壁細胞進行初步培養8天。

技術領域

本發明涉及一種分離免疫細胞的方法及其應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)是外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞和單核細胞。目前外周血單個核細胞主要的分離方法是Ficoll-hypaque(聚蔗糖－泛影葡胺)密度梯度離心法。

從1997年首次從外周血中分離并證實內皮祖細胞后，目前認為成人外周血、臍血及骨髓中均存在內皮祖細胞。內皮祖細胞在骨髓中的含量高于外周血，但也僅占骨髓單個核細胞的1％。因此，提高內皮祖細胞體外擴增數量并保持其低分化狀態是迫切需要我們解決的問題。骨髓中含有豐富的成體干細胞，研究證實，這些細胞來源于骨髓，具有旺盛的增殖能力，能夠直接分化為血管內皮細胞，在缺血等因素的刺激下，能夠動員入血，在受損血管的修復和缺血組織的再血管化中扮演著重要的角色。目前認為EPC可通過選用以下細胞標志來鑒定：vWF、CD31、Flk-1、Tie-2、CD133、CD144等，一些實驗室則通過血管內皮祖細胞培養后分化形成的成熟血管內皮細胞特征予以鑒定，包括鋪路石樣形態、管腔樣結構形成、Ⅷ因子、乙?；兔芏戎鞍?ac-LDL)、荊豆凝集素(UEA21)、CD34等。有報道認為CD31、CD34、KDR及Ⅷ因子等，均表達于成熟內皮細胞，是內皮細胞的特異表面標志。

本發明旨在提供采用體外密度梯度離心法，獲取外周血單個核細胞，再通過誘導其分化得到EPCs，經對EPCs的特異性檢測，驗證了其為靶標細胞EPCs。本發明為EPCs的研究提供一種簡單易行的細胞分離培養方法，更為大規模的EPCs基礎研究與臨床應用起到重要的推動作用。

發明內容

本發明的目的是提供一種分離免疫細胞的方法及其應用，采用體外密度梯度離心法，獲取外周血單個核細胞，再誘導其分化得到EPCs。本發明為EPCs的研究提供一種簡單易行的細胞分離培養方法，更為大規模的EPCs基礎研究與臨床應用起到重要的推動作用。

諸葛菜為十字花科諸葛菜屬植物，又名二月蘭，為一年生或越年生草本植物，花藍紫色、淡紅色或白色，成總狀花序，長角果線形，種子褐色，卵形。諸葛菜素D是現有技術有人從諸葛菜中分離得到的白色無定型粉末，易溶于甲醇、丙酮、二甲亞砜，微溶于乙醇、水，其分子結構式如下：

本申請第一次將諸葛菜素D應用于將外周血單個核細胞誘導分化得到EPCs，并且出乎意料的，還可以保持EPCs的不分化狀態，對大規模的EPCs基礎研究與臨床應用起到重要的意義。

本發明所需要解決的技術問題可以通過以下技術方案來實現。

一種分離免疫細胞并進一步誘導分化成EPCs的方法，其包括：

培養過程中應用了諸葛菜素D。

進一步優選，所述方法步驟如下：