[發明專利]一種誘導人臍帶華通膠間充質干細胞向髓核細胞分化方法

在審

• 申請號: 201910216216.4
• 申請日: 2019-03-20
• 公開（公告）號: CN109929801A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 焦陽;王鐵;朱迪·德瓦庫瑪;楊麗華;李靖
• 申請（專利權）人: 江蘇瑞思坦生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京潤文專利代理事務所(普通合伙) 11317
• 代理人: 韓豐年

本發明屬于生物醫學領域，具體涉及一種誘導人臍帶華通膠間充質干細胞向髓核細胞分化的方法。所述人臍帶華通膠間充質干細胞來源于健康新生兒棄用臍帶。本方法將人臍帶華通膠間充質干細胞誘導分化為髓核細胞，能夠補充人退變椎間盤內功能下降的髓核細胞的生物學作用，延緩或逆轉椎間盤退變，為椎間盤退變疾病開創新的治療方法。

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，特別是涉及一種誘導人臍帶華通膠間充質干細胞向髓核細胞分化方法。

背景技術

隨著生物學治療和干細胞技術的發展，大量新的治療方法已經在科研層面取得良好的效果和廣闊的前景。研究表面，干細胞在特殊誘導分化的調節下，具有向多種細胞增殖分化的潛能，從而彌補或代替退變細胞或組織的功能，從而達到理想的治療目的。這種方法既能夠克服單純使用藥物只能針對癥狀卻不能改變疾病本質的缺點，也能規避手術操作所帶來的附加損傷，目前，在針對一些小兒腦癱、心肌梗死等疾病已經有使用干細胞的研究報道，取得了良好的治療效果，因此，具有良好的醫學應用前景。

下腰痛是一種臨床上的常見病和多發病，對人們的勞動能力和日常生活帶來巨大影響，對社會和家庭帶來嚴重的經濟和醫療壓力。椎間盤退變使引起下腰痛的最主要的原因之一。其本質是髓核細胞退變，導致細胞外基質分泌不夠，自身大量凋亡或死亡，使椎間盤組織缺少營養支持，導致水分喪失，椎間盤高度下降，從而引發一系列臨床癥狀。目前，治療椎間盤退變的方法主要包括保守和手術治療兩類。均存在不同的優缺點，往往不能滿足患者的需要。原因在于，不能從根本上解決退變髓核生物學性能下降的本質，從而無法達到修復椎間盤的目的。

本研究從誘導人臍帶華通膠間充質干細胞向髓核細胞分化方法出發，將填補利用干細胞方法治療退變髓核組織的空白。

發明內容

本發明主要解決的技術問題是提供誘導人臍帶華通膠間充質干細胞向髓核細胞分化方法。操作簡單，效果顯著，且無醫學爭議，臍帶來源方便，為人體棄用組織，對人體不會造成附加損傷。

本發明提供的誘導人臍帶華通膠間充質干細胞向髓核細胞分化方法，其步驟如下：

一、人臍帶華通膠間充質干細胞的制備方法：

1、收集健康新生兒棄用臍帶，使用平衡鹽溶液洗去殘留血液，取臍帶華通膠組織，剪切成小碎塊，平衡鹽溶液沖洗后，在0.2％Ⅱ型膠原酶溶液中對碎塊組織進行消化，置37℃恒溫消化18小時；

2、采用2500rpm離心，共10min，棄上清，反復兩次后，對收集的細胞利用DMEM/F12培養基和胎牛血清培養，使胎牛血清濃度達到20％，于37℃，5％CO₂條件培養；

3、待細胞貼壁生長之后，換DMEM/F12完全培養基培養，待細胞融合達到80％以上時，棄上清，PBS洗細胞，0.25％胰蛋白酶消化5min，1000rpm離心，棄上清后用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養基進行培養，每3天進行換液。

4、0.2％膠原酶溶液的制備方法是：100mgⅡ型膠原酶加入50ml DMEM/F12培養基，完全溶解后，0.22μm過濾除菌。DMEM/F12完全培養基的制備方法：450ml DMEM/F12培養基內加入50ml特級胎牛血清，配置成含10％胎牛血清的完全培養基，加入青霉素及鏈霉素，使濃度為100u/mL青霉素、100μg/m L鏈霉素。

二、人髓核細胞的制備方法：

1、手術中取摘除的人正常髓核組織，去除纖維環及終板，PBS洗掉紅細胞。

2、將髓核組織剪成1.0mm³大小，經0.2mg/mL的II型膠原酶浸泡后，在37℃恒溫下消化4h，然后利用無菌鋼絲網(200mm)過濾組織碎片。1500rpm離心，5min，將上清液棄掉，將細胞沉淀物轉移至25ml的一次性塑料培養瓶中，并加入含10％FBS的細胞培養基。