[發明專利]一種誘導人臍帶華通膠間充質干細胞向髓核細胞分化方法

在審

• 申請號: 201910216216.4
• 申請日: 2019-03-20
• 公開（公告）號: CN109929801A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 焦陽;王鐵;朱迪·德瓦庫瑪;楊麗華;李靖
• 申請（專利權）人: 江蘇瑞思坦生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京潤文專利代理事務所(普通合伙) 11317
• 代理人: 韓豐年

1.一種誘導人臍帶華通膠間充質干細胞向髓核細胞分化方法，其特征在于，將人臍帶華通膠間充質干細胞與髓核細胞進行非接觸式共培養，然后分離提取人臍帶華通膠間充質干細胞。

2.根據權利要求1所述的誘導人臍帶華通膠間充質干細胞向髓核細胞分化方法，其特征在于，人臍帶華通膠間充質干細胞的制備方法為，收集健康新生兒棄用臍帶，使用平衡鹽溶液洗去殘留血液，取臍帶華通膠組織，剪切成小碎塊，平衡鹽溶液沖洗后，在0.2％Ⅱ型膠原酶溶液中對碎塊組織進行消化，置37℃恒溫消化18小時；采用2500rpm離心，共10min，棄上清，反復兩次后，對收集的細胞利用DMEM/F12培養基和胎牛血清培養；待細胞貼壁生長之后，換DMEM/F12完全培養基培養，待細胞融合達到80％以上時，進行傳代。

3.根據權利要求2所述的誘導人臍帶華通膠間充質干細胞向髓核細胞分化方法，其特征在于，其使用的足月產健康新生兒臍帶，且產婦的乙肝、梅毒、艾滋病免疫檢測均為陰性。

4.根據權利要求2所述的誘導人臍帶華通膠間充質干細胞向髓核細胞分化方法，其特征在于，0.2％膠原酶溶液的制備方法是：100mgⅡ型膠原酶加入50ml DMEM/F12培養基，完全溶解后，0.22μm過濾除菌。

5.根據權利要求2所述的誘導人臍帶華通膠間充質干細胞向髓核細胞分化方法，其特征在于，加DMEM/F12培養基和胎牛血清，使胎牛血清濃度達到20％，于37℃，5％CO₂條件培養進入下一工序。

6.根據權利要求2所述的誘導人臍帶華通膠間充質干細胞向髓核細胞分化方法，其特征在于，DMEM/F12完全培養基的制備方法：450ml DMEM/F12培養基內加入50ml特級胎牛血清，配置成含10％胎牛血清的完全培養基，加入青霉素及鏈霉素，使濃度為100u/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素。

7.根據權利要求2所述的誘導人臍帶華通膠間充質干細胞向髓核細胞分化方法，其特征在于，進行傳代培養的方法是：待細胞融合達到80-90％時，棄上清，PBS洗細胞，0.25％胰蛋白酶消化5min，1000rpm離心，棄上清后用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養基進行培養，每3天進行換液。

8.根據權利要求1所述的誘導人臍帶華通膠間充質干細胞向髓核細胞分化方法，其特征在于，髓核細胞的培養包括以下步驟：

(1)手術中取摘除的人正常髓核組織，去除纖維環及終板，PBS洗掉紅細胞。

(2)將髓核組織剪成1.0mm³大小，經0.2mg/mL的II型膠原酶浸泡后，在37℃恒溫下消化4h，然后利用無菌鋼絲網(200mm)過濾組織碎片。

(3)1500rpm離心，5min，將上清液棄掉，將細胞沉淀物轉移至25ml的一次性塑料培養瓶中，并加入含10％FBS的細胞培養基。

(4)37℃、5％CO2培養箱中進行培養3-5天。

(5)確認細胞貼壁生長后，每2～3天更換培養基，融合達到90％左右時，對細胞進行傳代培養。

9.根據權利要求1所述的誘導人臍帶華通膠間充質干細胞向髓核細胞分化方法，其特征在于，將兩種細胞接觸于帶有插入層的Transwell培養板內進行非接觸式共培養，7d后，收集人臍帶華通膠間充質干細胞。

10.根據權利要求9所述的誘導人臍帶華通膠間充質干細胞向髓核細胞分化方法，其特征在于，進行非接觸式共培養的兩種細胞均為穩定增殖的第3代細胞。