[發明專利]一種離體枝條接種對梨火疫病抗病性快速鑒定的方法

在審

• 申請號: 201910210814.0
• 申請日: 2019-03-20
• 公開（公告）號: CN110042143A
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: 羅明;李洪濤;袁英哲;韓劍;蔣萍;張祥林;唐章虎
• 申請（專利權）人: 新疆農業大學
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12Q1/6851;C12Q1/06;A01G7/06
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1.一種離體枝條接種對梨火疫病抗病性快速鑒定的方法，其特征在于通過以下步驟實現：

（1）梨火疫病菌接種液的制備：將梨火疫病菌經過致病力測定為強致病力的菌株接種于NA+5%蔗糖培養基上，28.5℃培養48h活化，挑取單菌落接種于NA+5%蔗糖培養液中，28.5℃、160 rpm/min振蕩培養12h，測定OD₆₀₀值為1.2左右的菌液利用滅菌水稀釋至10⁸作為接種液；

（2）離體枝條制備：選擇待測樣品的當年生幼嫩枝條作為供試材料，將供試枝條截至50cm左右的莖段，用75%酒精消毒后，將其1/3插入裝有0.5‰NaCl無菌鹽水的三角瓶中水培；

（3）接種：用滅菌手術刀在枝條3-4片葉的葉腋處切開一個約5mm²的傷口，用移液槍吸取2mL的梨火疫病原菌接種液滴在一塊約2cm²滅菌脫脂棉片上，將棉片貼在傷口部位，再用保鮮膜包裹，每個待測梨或蘋果品種（種質）接種30個離體枝條，以無菌水代替菌液作為對照；

（4）品種抗病性評價：將接種后的離體枝條置于相對濕度75%，溫度28.5℃，12h光照條件的人工氣候箱（室）中培養，枝條接種后每天觀察發病情況，接種10d后對接種枝條進行病情調查，計算發病率和病情指數，同時結合接種枝條病原菌熒光定量PCR檢測結果，根據梨火疫病抗病性等級劃分標準，綜合評估供試品種的抗病水平。

2.如權利要求1所述的梨火疫病品種抗病性評價方法，其特征在于，所述的接種枝條病情調查分級標準為：0級，枝條無病斑，葉片正常；Ⅰ級，枝條病斑長度占接種枝條長度的1%~5%，葉片變黑褐色，不脫落；Ⅲ級，枝條病斑長度占接種枝條長度的5.1%~15%，葉片變黑褐色，個別葉片脫落；Ⅴ級，枝條病斑長度占接種枝條長度的15.1%~30%，葉片變黑褐色，約三分之一葉片脫落；Ⅶ級，枝條病斑長度占接種枝條長度的30.1%~50%，葉片變黑褐色，約三分之一葉片脫落；Ⅸ級，枝條病斑長度占接種枝條長度＞50.1%，葉片變黑褐色，二分之一及以上葉片脫落。

3.如權利要求1所述的梨火疫病品種抗病性評價方法，其特征在于，所述的發病率及病情指數計算方法如下：發病率（%）=（發病枝條數/接種枝條數）×100%；病情指數=[∑（各級病株數×相應病級）/接種總株數×最高病級]×100。

4.如權利要求1所述的梨火疫病品種抗病性評價方法，其特征在于，所述的梨火疫病菌定量PCR檢測方法如下：將接種枝條經表面消毒后，截取接種口發病部位上下各1cm組織剪碎，浸泡于5 mL 0.5% NaCl溶液中過夜，吸取1mL菌懸液采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取浸提液中細菌DNA作為PCR模板，利用Erwinia amylovora特異性引物對P29TF：5’-CACTGATGGTGCCGTTG-3’，P29TR：5’-CGCCAGGATAGTCGCATA-3’進行實時熒光定量PCR檢測；實時熒光定量PCR檢測體系為25μL：TB Green Premix DimerEraser為12.5μL，10 μmol/L的上下游引物各0.5μL，ROX 0.5μL，DNA模板1μL，補足滅菌ddH₂O至25μL；熒光定量PCR檢測反應程序為：95 ℃預變性30s；95℃變性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循環40次；72℃收集熒光；反應結束后，利用分析軟件，設置基線和閾值，獲取檢測樣品的Ct值。

5.如權利要求1所述的梨火疫病品種抗病性評價方法，其特征在于，所述的梨火疫病抗病性等級劃分標準將抗病性等級分為高抗、抗病、耐病、中感、感病和高感；其劃分標準為：高抗：發病率<5%，病情指數0～5，Ct值>35；抗?。喊l病率5.1%～15%，病情指數5.1～15，Ct值33～35；耐?。喊l病率15.1%～40%，病情指數15.1～30，Ct值29～33；中感：發病率40.1%～75%，病情指數30.1～60，Ct值27～29；感?。喊l病率75.1%～90%，病情指數60.1～80，Ct值25～27；高感：發病率≥90.1%，病情指數>80.1，Ct＜25。