[發(fā)明專利]一種白及懸浮培養(yǎng)細胞中2;7-二羥基-4-甲氧基-9;10-二氫菲的定量檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910208640.4
• 申請日: 2019-03-19
• 公開（公告）號: CN109917034A
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發(fā)明（設計）人: 徐德林;潘胤池;肖世基;李林;上官艷妮;劉厚伯;姚文柯
• 申請（專利權(quán)）人: 遵義醫(yī)科大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 重慶強大凱創(chuàng)專利代理事務所(普通合伙) 50217
• 代理人: 向林

本方案公開了本方案公開了中藥材藥物研究技術(shù)領(lǐng)域的一種白及懸浮培養(yǎng)細胞中2,7?二羥基?4?甲氧基?9,10?二氫菲的定量測定方法，其中包括如下步驟：制備供試品溶液；制備對照品溶液；采用高效液相色譜法，分別對所述供試品溶液和對照品溶液進行檢測，分別獲得色譜圖；依據(jù)對照品色譜圖與供試品色譜圖中各自的2,7?二羥基?4?甲氧基?9,10?二氫菲峰面積，采用外標法計算所述待測白及懸浮培養(yǎng)細胞提取液中2,7?二羥基?4?甲氧基?9,10?二氫菲的含量。本發(fā)明檢測方法專屬性強，準確穩(wěn)定，重復性良好，采用該方法可以在細胞水平定量檢測白及懸浮培養(yǎng)細胞中特定的9,10?二氫菲類化學成分，為白及的進一步工業(yè)化高效生物合成該成分提供技術(shù)基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及中藥材藥物研究技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種白及懸浮培養(yǎng)細胞中2,7-二羥基 -4-甲氧基-9,10-二氫菲的定量檢測方法。

背景技術(shù)

白及(Bletilla striata(Thunb.)Rchb.f.)為蘭科白及屬多年生草本植物，是歷代藥典收錄的重要傳統(tǒng)中藥材，其味甘，性微寒，具有生肌治瘡、止血收斂的功效，可用于治療外傷出血等。9,10-二氫菲類化合物是目前報道的從白及中分離獲得最多的次生代謝產(chǎn)物之一。該類化合物具有較高的醫(yī)學研究價值，它對人癌細胞株HepG2的增殖有顯著地抑制作用，同時對枯草芽孢桿菌ATCC6633、金黃色葡萄球菌ATCC25923、白色念珠菌ATCC1057及發(fā)癬菌QM248等細菌也具有良好的抑制作用。

目前，利用植物細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)高效的促進細胞增殖和定向誘導次生代謝物的合成積累，已成為利用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物最有前景的生物合成方式。但是，國內(nèi)外研究對于檢測白及懸浮培養(yǎng)細胞中的其次生代謝產(chǎn)物尤其是9,10-二氫菲類化合物的研究卻無相關(guān)報道。白及懸浮培養(yǎng)細胞中普遍存在2,7-二羥基-4-甲氧基-9,10-二氫菲化合物，該化合物屬于9,10-二氫菲類化合物。因此，建立一種可以高效、準確、穩(wěn)定得定量檢測白及懸浮培養(yǎng)細胞中2,7-二羥基-4-甲氧基-9,10-二氫菲化合物的方法顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明意在提供一種白及懸浮培養(yǎng)細胞中2,7-二羥基-4-甲氧基-9,10-二氫菲的定量檢測方法，以解決現(xiàn)有白及細胞懸浮培養(yǎng)中無法精確定量測定細胞中次生代謝產(chǎn)物2,7-二羥基 -4-甲氧基-9,10-二氫菲累積情況的技術(shù)問題。

本方案中的一種白及懸浮培養(yǎng)細胞中2,7-二羥基-4-甲氧基-9,10-二氫菲的定量檢測方法，包括以下步驟：

步驟一、取烘干后白及懸浮培養(yǎng)細胞，以甲醇水溶液為溶劑加熱回流提取，提取液經(jīng)回收溶劑后得到的殘留物用甲醇水溶解轉(zhuǎn)移定容，過濾，得到濃度為0.04g/ml～0.4g/ml的供試品溶液；

步驟二、取2,7-二羥基-4-甲氧基-9,10-二氫菲對照品，以甲醇水溶液為溶劑溶解，過濾，得到濃度為0.1mg/ml～0.0025mg/ml的對照品溶液；

步驟三、采用高效液相色譜法，分別對所述供試品溶液和對照品溶液進行檢測，分別獲得供試品色譜圖和對照品色譜圖；所述檢測條件具體為：

色譜柱的尺寸為：柱長150mm～250mm，柱內(nèi)徑為2mm～5mm，色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，所述填充劑的顆粒直徑為5μm～10μm；

檢測波長為225nm，柱溫為25℃～30℃，流速為0.8ml/min～1.0ml/min；

流動相由流動相A和流動相B組成，其中流動相A為甲醇，流動相B為超純水，按如下條件進行洗脫：

0～10min：流動相A占流動相總體積的百分比由20％增加到25％；

10～25min：流動相A占流動相總體積的百分比由25％增加到50％；

25～35min：流動相A占流動相總體積的百分比保持50％不變；