[發明專利]一種白及懸浮培養細胞中2;7-二羥基-4-甲氧基-9;10-二氫菲的定量檢測方法

在審

• 申請號: 201910208640.4
• 申請日: 2019-03-19
• 公開（公告）號: CN109917034A
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發明（設計）人: 徐德林;潘胤池;肖世基;李林;上官艷妮;劉厚伯;姚文柯
• 申請（專利權）人: 遵義醫科大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 重慶強大凱創專利代理事務所(普通合伙) 50217
• 代理人: 向林

1.一種白及懸浮培養細胞中2,7-二羥基-4-甲氧基-9,10-二氫菲的定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、取烘干后白及懸浮培養細胞，以甲醇水溶液為溶劑加熱回流提取，提取液經回收溶劑后得到的殘留物用甲醇水溶液溶解轉移定容，過濾，得到濃度為0.04g/ml～0.4g/ml的供試品溶液；

步驟二、取2,7-二羥基-4-甲氧基-9,10-二氫菲對照品，以甲醇水溶液為溶劑溶解，過濾，得到濃度為0.1mg/ml～0.0025mg/ml的對照品溶液；

步驟三、采用高效液相色譜法，分別對所述供試品溶液和對照品溶液進行檢測，分別獲得供試品色譜圖和對照品色譜圖；所述檢測條件具體為：

色譜柱的尺寸為：柱長150mm～250mm，柱內徑為2mm～5mm，色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，所述填充劑的顆粒直徑為5μm～10μm；

檢測波長為225nm，柱溫為25℃～30℃，流速為0.8ml/min～1.0ml/min；

流動相由流動相A和流動相B組成，其中流動相A為甲醇，流動相B為超純水，按如下條件進行洗脫：

0～10min：流動相A占流動相總體積的百分比由20％增加到25％；

10～25min：流動相A占流動相總體積的百分比由25％增加到50％；

25～35min：流動相A占流動相總體積的百分比保持50％不變；

35～50min：流動相A占流動相總體積的百分比由50％增加到100％；

50～60min：流動相A占流動相總體積的百分比保持100％不變；

步驟四、依據所述對照品色譜圖與所述供試品色譜圖中各自的2,7-二羥基-4-甲氧基-9,10-二氫菲峰面積，采用外標法計算所述待測白及懸浮培養細胞提取液中2,7-二羥基-4-甲氧基-9,10-二氫菲的含量；

其中，所述甲醇水溶液的濃度為70％～100％。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于：還包括制備定位用對照品溶液的步驟，制備所述定位用對照品溶液具體為取不同質量的2,7-二羥基-4-甲氧基-9,10-二氫菲對照品配置成不同質量濃度的對照品溶液，以甲醇水溶液為溶劑溶解即得；

采用步驟三所述高效液相色譜法檢測所述定位所用對照品溶液，獲得定位用對照品色譜圖；

步驟四依據所述定位用對照品色譜圖與所述供試品色譜圖中各自的2,7-二羥基-4-甲氧基-9,10-二氫菲峰及峰面積，采用外標法計算所述待測白及懸浮培養細胞提取液中2,7-二羥基-4-甲氧基-9,10-二氫菲峰的含量。

3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于：步驟一中白及懸浮培養細胞由繼代培養3～4代30～45天生長良好、質地疏松、生長狀況一致的白及愈傷組織作為液體懸浮培養的外植體懸浮培養而來；懸浮培養基為MS+6-芐氨基嘌呤1.5±0.45mg/L+2,4-二氯苯氧乙酸2.5±0.5mg/L+30±20g/L蔗糖，懸浮培養基的pH為6.0±0.2；外植體的接種量與培養基的體積比例為1/80～1/20g/mL；接種后在轉速為120±10r/min、溫度為25±2℃的黑暗條件下進行振蕩懸浮培養，懸浮培養時間為40～45天。

4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于：步驟一中甲醇水溶液的濃度為70％，回流提取1～3次，每次提取2～4小時。

5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特征在于：步驟一中采用濃度為70％的甲醇回流提取2次，每次提取3小時。

6.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于：步驟三中，所述供試品溶液與所述對照品溶液的進樣量均為20μl。

7.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于：步驟一中供試品溶液的濃度為0.4g/ml；步驟二中對照品溶液的濃度0.025g/ml。

8.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于：步驟三中，柱溫為25℃，流速為0.8ml/min。

9.根據權利要求8所述的檢測方法，其特征在于：步驟三中，柱長為250mm，柱內徑為4.6mm，填充劑的顆粒直徑為5μm。