[發明專利]一種批量制備人工誘導雌核發育石斑魚的方法

在審

• 申請號: 201910207746.2
• 申請日: 2019-03-19
• 公開（公告）號: CN109717107A
• 公開（公告）日: 2019-05-07
• 發明（設計）人: 駱劍;梁業松;樊佳偉;張維煒;何靖;吳延昌;鄧成
• 申請（專利權）人: 海南大學
• 主分類號: A01K61/10
• 分類號: A01K61/10
• 代理公司: ?？谙柘鑼＠聞沼邢薰?46001
• 代理人: 張耀婷

1.一種批量制備人工誘導雌核發育石斑魚的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)石斑魚精子遺傳物質批量滅活處理

a、雄魚的選擇和精子的采集：選擇體格健壯、體重為60～80kg/尾的鞍帶石斑魚雄性成魚為親本，置于海上網箱或陸地池塘進行培育，投喂冰鮮雜魚和魷魚進行培育；待海水平均溫度穩定在28～32℃時，采用麻醉劑將其麻醉后撈出水面置于帆布擔架內擠精；得到鞍帶石斑魚鮮精后，使用精子稀釋液按照1:8～10比例稀釋，0～4℃冷藏保存；

b、精子遺傳物質批量滅活：將8個培養皿同時鋪上稀釋過的鞍帶石斑魚精液，精子液面厚度控制在0.25～0.35mm，置于紫外燈箱中照射；每次照射時間為4分鐘，照射過程中遮蔽自然光并置于搖床中進行，保持60～80rpm搖動速度以確保精子照射均勻，紫外光照射劑量為40～60mJ/cm²，照射后快速將照射液轉入收集管進行收集，于0～4℃冷藏避光保存，以備用；

c、人工授精的方法：鞍帶石斑魚精子紫外照射處理完成后，收集精子置于冰上避光保存；將待產棕點石斑魚雌魚撈出，擦干體表水分，將成熟卵子擠入干燥刻度燒杯中；按照1ml處理精子授精10ml卵子的比例進行精卵人工混合，混合后加入潔凈自然海水攪拌30秒，完成人工授精；

(2)批量冷休克誘導石斑魚卵子

使用制冷機提前制備預冷的海水，往冷休克處理箱注入預冷海水，并與制冷機連接循環控溫；人工干拌法授精后7分鐘，按照每50ml卵子使用2000～4000ml預冷3.5～4.5℃海水的比例立即轉入裝有預冷海水的冷休克處理箱中，低溫休克處理10分鐘；經孵化桶孵化獲得人工培育石斑魚魚苗；

(3)人工雌核發育誘導質量控制

采用正常雜交組、精子照射未休克組及雌核發育組，來實現制備人工雌育的質量控制；收集三個組發育超過16小時的胚胎，DAPI染色，Partac倍性分析儀檢測，正常雜交組孵化率≥80％；精子照射未休克組受精率≥60％，二倍體率和孵化率＜10％以下；雌核發育組≥60％，孵化率≥30％即為合格人工雌核發育。