[發明專利]一種超臨界二氧化碳中固定化脂肪酶活性的測定方法

在審

• 申請號: 201910206822.8
• 申請日: 2019-03-19
• 公開（公告）號: CN109750083A
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發明（設計）人: 詹世平;王景昌;商雪航;侯維敏
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: C12Q1/44
• 分類號: C12Q1/44
• 代理公司: 大連八方知識產權代理有限公司 21226
• 代理人: 衛茂才

本發明涉及生物醫用高分子材料制備的技術領域，具體是一種超臨界二氧化碳(ScCO₂)中固定化脂肪酶活性的測定方法。采用聚乙烯醇和橄欖油溶液為底物，氨基化二氧化硅固定化豬胰脂肪酶為酶催化劑，應用酸堿滴定法測定了固定化酶在超臨界二氧化碳中的催化活性。本發明方法對于掌握固定化酶在超臨界二氧化碳中的催化活性，在超臨界二氧化碳中應用固定化酶做催化劑，合成生物醫用高分子材料都是非常重要的。本發明的測定方法原料和溶劑均為綠色試劑，測量方法準確簡單，無需大型儀器設備，是一種具有廣泛應用前景的固定化酶活性的測試方法。

技術領域

本發明涉及生物醫用高分子材料制備的技術領域，具體是一種超臨界二氧化碳中固定化脂肪酶活性的測定方法。

技術背景

酶催化合成生物可降解脂肪族聚酯是一種新型聚合方法，可以在溫和條件下高效合成，有著傳統方法難以比擬的優勢，但該方法所合成的產物仍存在生物相容性低、機械性能差、分子量低等不足。但是通過酶的固定化、功能化改性、調節支鏈等方法可以提高酶的催化效率和活性、降低反應能耗和材料中殘留的有毒物質、提高原料轉化率和產物分子量、增強產物親水性及開發材料新用途。近年來固載化脂肪酶的技術得到很大的發展，固定化技術使酶穩定性大幅度提高，單位酶的生產力提高，以及重復利用性明顯提高。超臨界二氧化碳（ScCO₂）作為反應介質已經被廣泛應用于高分子聚合反應工程，且ScCO₂作為反應介質具有有機溶劑無法比擬的優勢。本發明采用聚乙烯醇和橄欖油溶液為底物，氨基化二氧化硅固定化豬胰脂肪酶為酶催化劑，應用酸堿滴定法測定了固定化酶在ScCO₂中的催化活性。掌握固定化酶在超臨界二氧化碳中的催化活性，對于在超臨界二氧化碳中應用固定化酶做催化劑，合成生物醫用高分子材料是非常重要的，固定化酶在超臨界二氧化碳中活性是應用超臨界二氧化碳作反應溶劑的基礎數據，因此需要一種簡便高效的在超臨界二氧化碳中測定固定化酶活性的方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種超臨界二氧化碳中固定化脂肪酶活性的測定方法。

為實現上述發明目的，本發明的技術方案如下：

一種超臨界二氧化碳中固定化脂肪酶活性的測定方法，所述方法采用聚乙烯醇和橄欖油溶液為底物，氨基化二氧化硅固定化豬胰脂肪酶為酶催化劑，應用酸堿滴定法測定了固定化酶在超臨界二氧化碳中的催化活性。

上述一種超臨界二氧化碳中固定化脂肪酶活性的測定方法，所述方法包括以下步驟：

（1）底物溶液的配置：聚乙烯醇與橄欖油混合，調節底物溶液pH值為6~10，經高速勻質機處理，備用；

（2）待測酶液的制備：氨基化二氧化硅固定化豬胰脂肪酶樣品溶解至PBS溶液中，備用；

（3）活性測定過程：將反應釜、底物溶液、酶液分別預熱至溫度50℃，然后將底物溶液和酶液加入到反應釜中，反應系統用二氧化碳吹掃，關閉出氣閥，加熱升溫至反應溫度49~110℃，打壓至反應壓力8~15 MPa MPa，磁力攪拌下保壓反應，反應結束后，于釜中加入15 mL95%乙醇溶液終止反應，反應液用氫氧化鈉標準溶液滴定，至顏色變為粉紅，根據消耗氫氧化鈉標準溶液的體積計算出固定化脂肪酶活性。

可選的，所述步驟（1）中聚乙烯醇的濃度為4%，聚乙烯醇與橄欖油的體積比為3:1，底物溶液pH值為9。

可選的，所述步驟（2）中控制酶液濃度，使樣品與對照品消耗堿量之差在1~2 mL范圍內。

可選的，所述步驟（2）中氨基化二氧化硅固定化豬胰脂肪酶樣品0.1~0.2 g溶解到20 mL PBS溶液中。

進一步的，所述步驟（2）中氨基化二氧化硅固定化豬胰脂肪酶樣品0.2 g溶解到20mL PBS溶液中。

可選的，所述步驟（3）中橄欖油與氨基化二氧化硅固定化豬胰脂肪酶的質量比為100:1。