[發明專利]核苷酸序列tWPRE及其基因表達載體和應用

在審

• 申請號: 201910201832.2
• 申請日: 2019-03-18
• 公開（公告）號: CN109929864A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 楊蕊菊;楊興林;劉曉芬;夏清梅;楊佳麗
• 申請（專利權）人: 和元生物技術（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/864;C12N7/01;C07K14/02
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中;王永偉

本發明屬于基因工程領域，更具體地說本發明涉及一種含有WPRE?polyA元件的核苷酸序列tWPRE及其基因表達載體和應用。所述含有WPRE?polyA元件的核苷酸序列tWPRE的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述基因表達載體包括上述的核苷酸序列tWPRE。本發明進一步改進了WPRE?polyA元件，得到了優化元件tWPRE，同時在質粒轉染和病毒感染兩方面驗證了tWPRE元件的有效性，在擴大載體容量的同時保證了高效的轉基因表達效率和病毒感染效率，有助于AAV載體攜帶更多的特異性啟動子和基因，擴大了AAV病毒的作用范圍，為基礎科研和臨床研究提供了一種新的更特異且更高效的表達工具。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，更具體地說本發明涉及一種核苷酸序列tWPRE及其基因表達載體和應用。

背景技術

腺相關病毒載體系統(AAV)具有低免疫原性，能感染分裂和非分裂細胞，以及在宿主細胞中維持長程表達，與慢病毒載體系統相比，在實現基因治療人類疾病中表現出絕對的優勢。目前，腺相關病毒載體系統(AAV)在國外已被用于多種基因療法并進入臨床試驗，且取得良好效果，如失明、心臟病、肌營養不良、聽覺喪失，肺癌、帕金森患者腦部等疾病。同時目前還沒有發現任何一例以腺相關病毒載體為基因導入系統的臨床試驗出現副作用或嚴重死亡事件等，證明了腺相關病毒載體系統(AAV)的安全可靠性。除了臨床應用，AAV載體也在基礎研究領域中得到了廣泛的應用。

雖然AAV載體具有很多其它病毒載體無法比擬的優勢,但是AAV載體包裝的常規承載量只有4.2-4.7kbp，不足以攜帶較大片段的組織特異性啟動子或者特定的大片段基因表達，這在一定程度上局限了AAV載體的使用范圍。因此，改進AAV載體元件，增加載體容量，有助于AAV病毒載體攜帶更多的外源核酸物質，為基礎科研和臨床研究提供更特異，更高效的表達工具。

WPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatoryelement)即土撥鼠乙肝病毒轉錄后調控元件，長度大約600bp，屬于順式作用元件(DNA序列)，由gamma，alpha，beta等三部分構成。WPRE的主要功能如下：1)參與AAV病毒的包裝；2)幫助檢測AAV病毒的滴度；3)同時有效幫助mRNA的polyA加尾效率，增強轉基因的表達和穩定。poly(A)可以終止轉錄，將poly(A)補加到轉錄體的3’端，增強RNA的穩定性，提高翻譯效率；部分長度的poly(A)對目的基因終止可能沒有太大影響，但對蛋白表達可能會有一定影響。

因此，WPRE和poly(A)這兩個元件對AAV病毒的包裝和基因表達具有重要的作用。有研究報道，保留gamma和alpha部分的WPRE元件可以與SV40poly(A)融合成為只有399bp長度的片段，可以維持AAV病毒的包裝和轉基因的表達，然而忽略了病毒滴度的檢測。因此，如何在不影響病毒包裝、滴度檢測和表達的前提下，盡可能增大載體容量，擴大AAV病毒的作用范圍，仍然有待于進一步研究和改進。

發明內容

本發明公開了一種含有WPRE-polyA元件的核苷酸序列tWPRE，包括所述tWPRE序列的基因表達載體可在不影響病毒包裝、滴度檢測和表達的前提下，盡可能的增大載體容量，擴大了AAV病毒的作用范圍，為基礎科研和臨床研究提供了一種新的更特異且更高效的表達工具。

本發明的具體方案如下：

本發明一方面公開了一種含有WPRE-polyA元件的核苷酸序列tWPRE，所述tWPRE的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

應該理解，在保持功能不變的情況下，與上述序列(及本發明中的其他序列)具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的序列也在本發明的保護范圍之內。所述的序列的差異由堿基的取代、缺失或添加所致，本領域技術人員有能力，例如通過非保守堿基的替換，獲得功能相似的序列，這樣的序列在本發明的保護范圍之內。