[發(fā)明專利]一種利用人胚腎上皮細(xì)胞重組表達(dá)Lp-PLA2的工藝方法

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• 申請日: 2019-03-18
• 公開（公告）號(hào): CN109837260A
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴瞻
• 申請（專利權(quán)）人: 南京歐凱生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/18
• 分類號(hào): C12N9/18;C12N15/85;C12N15/55
• 代理公司: 北京挺立專利事務(wù)所(普通合伙) 11265
• 代理人: 倪鉅芳

本發(fā)明提供一種利用人胚腎上皮細(xì)胞重組表達(dá)磷脂酶A2（Lp?PLA2）的工藝方法，包括以下步驟：首先將Lp?PLA2基因片段采用密碼子優(yōu)化軟件進(jìn)行優(yōu)化，通過PCR合成Lp?PLA2基因片段，然后將合成的基因片段插入到表達(dá)載體中，構(gòu)建Lp?PLA2表達(dá)質(zhì)粒，利用轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)Lp?PLA2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入人胚腎細(xì)胞（HEK293）中，從而瞬時(shí)表達(dá)可溶性Lp?PLA2蛋白，最后通過親和層析方法提取獲得重組表達(dá)的Lp?PLA2蛋白。本發(fā)明提供的方法可獲得具有翻譯后修飾的生物功能活性Lp?PLA2蛋白，同時(shí)提高Lp?PLA2在人胚腎細(xì)胞（HEK293）中表達(dá)產(chǎn)量，這對于Lp?PLA2蛋白的功能研究和免疫診斷試劑盒開發(fā)帶來了很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用人胚腎上皮細(xì)胞重組表達(dá)Lp-PLA2的工藝方法。

背景技術(shù)

脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)，是由441個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量為45kDa，以活性形式存在于血液循環(huán)中。目前，大量的流行病學(xué)研究和臨床前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，血漿Lp-PLA2濃度或活性升高是心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，并且比傳統(tǒng)危險(xiǎn)因子對心血管病具有更強(qiáng)的預(yù)測能力。基于Lp-PLA2是心血管事件獨(dú)立危險(xiǎn)因素的這一研究結(jié)論，Lp-PLA2將成為抗AS治療的新靶點(diǎn)。二期臨床試驗(yàn)證實(shí)，Lp-PLA2的選擇性抑制劑Darapladib，能阻止AS斑塊壞死核心容積擴(kuò)展，降低斑塊的易損性。早期研究中發(fā)現(xiàn)，PAF具有極強(qiáng)的生物學(xué)活性，能促進(jìn)血小板聚集、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞趨化以及促進(jìn)白三烯等大量炎癥介質(zhì)釋放，而Lp-PLA2能水解PAF使其失活，同時(shí)臨床前研究試驗(yàn)結(jié)果表明：Lp-PLA2的抑制劑能夠減弱炎癥反應(yīng)。因此，Lp-PLA2還可作為一種新的治療靶點(diǎn)。2005年美國食品藥物管理局已批準(zhǔn)將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2作為心血管病及缺血性卒中的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)因素,與高血壓、糖尿病、代謝綜合征也有一定的關(guān)系。因此，脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2越來越受到重視，近年來被廣泛研究。

目前，用于表達(dá)重組Lp-PLA2蛋白系統(tǒng)包括原核表達(dá)，酵母表達(dá)，昆蟲表達(dá)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)。其中，原核表達(dá)系統(tǒng)不具有翻譯后修飾功能，表達(dá)出蛋白易形成包涵體，沒有生物活性；而哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可對Lp-PLA2蛋白進(jìn)行接近天然的糖基化等修飾，能夠滿足制備抗體和研發(fā)診斷試劑的需求。

發(fā)明內(nèi)容

基于以上現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的在于提供一種利用人胚腎上皮細(xì)胞重組表達(dá)Lp-PLA2的工藝方法，主要解決現(xiàn)有表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組Lp-PLA2蛋白低生物功能活性，以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)量較低等問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

1、一種利用人胚腎上皮細(xì)胞重組表達(dá)Lp-PLA2的工藝方法，包括以下步驟：

(1)對Lp-PLA2基因片段進(jìn)行密碼子優(yōu)化；

(2)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒：合成步驟(1)優(yōu)化后基因片段，連接到表達(dá)載體上，獲得Lp-PLA2表達(dá)質(zhì)粒；

(3)將步驟(2)中表達(dá)質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染入人胚腎上皮細(xì)胞HEK293中，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和Lp-PLA2蛋白瞬時(shí)表達(dá)；

(4)收集步驟(3)中分泌表達(dá)Lp-PLA2蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)行分離純化獲得Lp-PLA2蛋白。

為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，進(jìn)一步的，步驟(1)中密碼子優(yōu)化采用德泰生物最新開發(fā)的密碼子優(yōu)化軟件MaxCodon^TM Optimization Program(V13)，優(yōu)化后密碼子適用于表達(dá)宿主細(xì)胞偏愛性。

為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，進(jìn)一步的，步驟(2)中所述構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，具體步驟包括：引物設(shè)計(jì)與合成，PCR獲取Lp-PLA2基因片段，重組連接獲取表達(dá)質(zhì)粒。

為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，進(jìn)一步的，步驟(2)中表達(dá)載體為德泰生物研發(fā)的適用于人胚腎上皮細(xì)胞特異性的表達(dá)載體。