[發明專利]一種利用人胚腎上皮細胞重組表達Lp-PLA2的工藝方法

在審

• 申請號: 201910201825.2
• 申請日: 2019-03-18
• 公開（公告）號: CN109837260A
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發明（設計）人: 戴瞻
• 申請（專利權）人: 南京歐凱生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N15/85;C12N15/55
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 倪鉅芳

本發明提供一種利用人胚腎上皮細胞重組表達磷脂酶A2（Lp?PLA2）的工藝方法，包括以下步驟：首先將Lp?PLA2基因片段采用密碼子優化軟件進行優化，通過PCR合成Lp?PLA2基因片段，然后將合成的基因片段插入到表達載體中，構建Lp?PLA2表達質粒，利用轉染試劑介導Lp?PLA2表達質粒轉入人胚腎細胞（HEK293）中，從而瞬時表達可溶性Lp?PLA2蛋白，最后通過親和層析方法提取獲得重組表達的Lp?PLA2蛋白。本發明提供的方法可獲得具有翻譯后修飾的生物功能活性Lp?PLA2蛋白，同時提高Lp?PLA2在人胚腎細胞（HEK293）中表達產量，這對于Lp?PLA2蛋白的功能研究和免疫診斷試劑盒開發帶來了很好的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種利用人胚腎上皮細胞重組表達Lp-PLA2的工藝方法。

背景技術

脂蛋白相關磷脂酶A2(Lp-PLA2)，是由441個氨基酸組成的蛋白質，分子量為45kDa，以活性形式存在于血液循環中。目前，大量的流行病學研究和臨床前瞻性研究發現，血漿Lp-PLA2濃度或活性升高是心血管事件的獨立危險因子，并且比傳統危險因子對心血管病具有更強的預測能力。基于Lp-PLA2是心血管事件獨立危險因素的這一研究結論，Lp-PLA2將成為抗AS治療的新靶點。二期臨床試驗證實，Lp-PLA2的選擇性抑制劑Darapladib，能阻止AS斑塊壞死核心容積擴展，降低斑塊的易損性。早期研究中發現，PAF具有極強的生物學活性，能促進血小板聚集、中性粒細胞和單核細胞趨化以及促進白三烯等大量炎癥介質釋放，而Lp-PLA2能水解PAF使其失活，同時臨床前研究試驗結果表明：Lp-PLA2的抑制劑能夠減弱炎癥反應。因此，Lp-PLA2還可作為一種新的治療靶點。2005年美國食品藥物管理局已批準將脂蛋白相關磷脂酶A2作為心血管病及缺血性卒中的風險評價因素,與高血壓、糖尿病、代謝綜合征也有一定的關系。因此，脂蛋白相關磷脂酶A2越來越受到重視，近年來被廣泛研究。

目前，用于表達重組Lp-PLA2蛋白系統包括原核表達，酵母表達，昆蟲表達，哺乳動物細胞表達。其中，原核表達系統不具有翻譯后修飾功能，表達出蛋白易形成包涵體，沒有生物活性；而哺乳動物細胞表達系統可對Lp-PLA2蛋白進行接近天然的糖基化等修飾，能夠滿足制備抗體和研發診斷試劑的需求。

發明內容

基于以上現有技術，本發明的目的在于提供一種利用人胚腎上皮細胞重組表達Lp-PLA2的工藝方法，主要解決現有表達系統表達重組Lp-PLA2蛋白低生物功能活性，以及哺乳動物細胞表達系統產量較低等問題。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

1、一種利用人胚腎上皮細胞重組表達Lp-PLA2的工藝方法，包括以下步驟：

(1)對Lp-PLA2基因片段進行密碼子優化；

(2)構建表達質粒：合成步驟(1)優化后基因片段，連接到表達載體上，獲得Lp-PLA2表達質粒；

(3)將步驟(2)中表達質粒通過轉染試劑介導，轉染入人胚腎上皮細胞HEK293中，進行細胞培養和Lp-PLA2蛋白瞬時表達；

(4)收集步驟(3)中分泌表達Lp-PLA2蛋白細胞培養基，進行分離純化獲得Lp-PLA2蛋白。

為了更好的實現本發明，進一步的，步驟(1)中密碼子優化采用德泰生物最新開發的密碼子優化軟件MaxCodon^TM Optimization Program(V13)，優化后密碼子適用于表達宿主細胞偏愛性。

為了更好的實現本發明，進一步的，步驟(2)中所述構建表達質粒，具體步驟包括：引物設計與合成，PCR獲取Lp-PLA2基因片段，重組連接獲取表達質粒。

為了更好的實現本發明，進一步的，步驟(2)中表達載體為德泰生物研發的適用于人胚腎上皮細胞特異性的表達載體。