[發明專利]一種利用人胚腎上皮細胞重組表達Lp-PLA2的工藝方法

在審

• 申請號: 201910201825.2
• 申請日: 2019-03-18
• 公開（公告）號: CN109837260A
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發明（設計）人: 戴瞻
• 申請（專利權）人: 南京歐凱生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N15/85;C12N15/55
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 倪鉅芳

1.一種利用人胚腎上皮細胞重組表達Lp-PLA2的工藝方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）對Lp-PLA2基因片段進行密碼子優化；

（2）構建表達質粒：合成步驟（1）優化后基因片段，連接到表達載體上，獲得Lp-PLA2表達質粒；

（3）將步驟（2）中表達質粒通過轉染試劑介導，轉染入人胚腎上皮細胞HEK293中，進行細胞培養和Lp-PLA2蛋白瞬時表達；

（4）收集步驟（3）中分泌表達Lp-PLA2蛋白細胞培養基，進行分離純化獲得Lp-PLA2蛋白。

2.根據權利要求1所述的一種利用人胚腎上皮細胞重組表達Lp-PLA2的工藝方法，其特征在于，步驟（1）中密碼子優化采用德泰生物最新開發的密碼子優化軟件MaxCodon^TMOptimization Program (V13)，優化后密碼子適用于表達宿主細胞偏愛性。

3.根據權利要求1所述的一種利用人胚腎上皮細胞重組表達Lp-PLA2的工藝方法，其特征在于，步驟（2）中所述構建表達質粒，具體步驟包括：引物設計與合成，PCR獲取Lp-PLA2基因片段，重組連接獲取表達質粒。

4.根據權利要求1所述的一種利用人胚腎上皮細胞重組表達Lp-PLA2的工藝方法，其特征在于，步驟（2）中表達載體為德泰生物研發的適用于人胚腎上皮細胞特異性的表達載體。

5.根據權利要求1所述的一種利用人胚腎上皮細胞重組表達Lp-PLA2的工藝方法，其特征在于，步驟（3）中將表達質粒轉染人胚腎上皮細胞轉染方法為化學試劑法，具體步驟包括：種子細胞培養，形成質粒DNA-轉染試劑復合物，將所述復合物加入所述種子細胞中。

6.根據權利要求1所述的一種利用人胚腎上皮細胞重組表達Lp-PLA2的工藝方法，其特征在于，步驟（3）所述HEK293細胞培養，采用無血清懸浮培養。

7.根據權利要求1所述的一種利用人胚腎上皮細胞重組表達Lp-PLA2的工藝方法，其特征在于，在步驟（3）細胞培養表達過程中通過補料優化提高Lp-PLA2蛋白的表達量，補料包括L-Glutamine，胰酪蛋白胨，葡萄糖。

8.根據權利要求1所述的一種利用人胚腎上皮細胞重組表達Lp-PLA2的工藝方法，其特征在于，步驟（4）中分離純化條為親和層析，采用Ni-IDA Beads分離提純Lp-PLA2蛋白，具體步驟包括：離心收集分泌表達Lp-PLA2蛋白細胞培養基上清，上清進行預處理，Ni-IDABeads親和純化，梯度洗脫獲取蛋白。

9.根據權利要求7所述的一種利用人胚腎上皮細胞重組表達Lp-PLA2的工藝方法，其特征在于，補料條件為：轉染后48h添加4-8mM/L L-Glutamine，5-10mg/L胰酪蛋白胨，3-4mg/L葡萄糖。