[發明專利]一種檢測人類MIF基因CATT重復序列純合子的試劑盒及步驟

在審

• 申請號: 201910200999.7
• 申請日: 2019-03-18
• 公開（公告）號: CN111705120A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 崔東紅;殷東敏
• 申請（專利權）人: 上海市精神衛生中心（上海市心理咨詢培訓中心）;華東師范大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6844
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測人類MIF基因CATT重復序列純合子的試劑盒，其特征在于，該試劑盒由探針結合預混液、酶促反應預混液、信號放大預混液、純合子陽性對照品、陰性對照以及標準品組成；

所述探針結合預混液包括含有特異性識別MIF基因啟動子區域的帶有特定修飾的環鎖核酸探針、RecA蛋白、單鏈結合蛋白以及促進探針結合的緩沖液A；

所述酶促反應預混液包括能夠在室溫條件下反應且不具有3’-5’外切酶活性的聚合酶、在37 ℃下具有活性的高保真連接酶、四種隨機脫氧核糖核苷酸dNTP以及促進酶反應活性的緩沖液B；

所述信號放大預混液包括具有鏈置換活性的等溫擴增酶、鏈置換等溫擴增的引物、dNTP、結合雙鏈DNA的SYBR? Green熒光染料、促進酶反應活性的緩沖液C；

所述純合子陽性對照品為與探針結合預混液中環鎖核酸探針結合但不促進環鎖探針成環的合成DNA雙鏈片段；

所述陰性對照品為與探針結合預混液中環鎖核酸探針結合且促進環鎖探針成環的合成DNA雙鏈片段；

所述標準品為用于熒光計檢測的雙鏈DNA片段，有低濃度DNA和高濃度DNA兩管組分組。

2.根據權利要求1所述的一種檢測人類MIF基因CATT重復序列純合子的試劑盒，其特征在于，緩沖液A包括Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP、EDTA和甘油，緩沖液A的pH為7.6。

3.根據權利要求1所述的一種檢測人類MIF基因CATT重復序列純合子的試劑盒，其特征在于，緩沖液B包括Tris-HCl、醋酸鉀、醋酸鎂、NADⅠ型輔酶、DTT、Triton X-100和甘油，緩沖液B的pH為7.6。

4.根據權利要求1所述的一種檢測人類MIF基因CATT重復序列純合子的試劑盒，其特征在于，緩沖液C包括Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4、DTT和甘油，緩沖液C的pH為7.5。

5.一種檢測人類MIF基因CATT重復序列純合子的試劑盒的操作步驟，其特征在于，

第一步，探針結合反應：在干凈的無核酸酶反應管中用移液器加入30-100ng純化的樣本人源基因組DNA或對照組樣品分別與一次反應所需的探針結合預混液，37℃反應15min，人源基因組須從體細胞采樣，比如抽提自全血白細胞基因組DNA、口腔上皮細胞DNA；

第二步，酶促反應：等體積在各反應管中用移液器加入一次反應所需的酶促反應預混液，移液器至少10次吹打混勻后，37℃反應25min；

第三步，信號放大：按照稀釋倍數對應的體系再各反應管中用移液器加入一次反應所需的預混液C，37℃反應2h。

6.第四步，信號檢測：按照熒光計操作說明書，配制工作液，先測定標準品熒光值定兩點法的標曲，再讀取各樣本的熒光值，根據熒光值判定檢測結果是否為CATT5純合子。