[發明專利]一種檢測人類MIF基因CATT重復序列純合子的試劑盒及步驟

在審

• 申請號: 201910200999.7
• 申請日: 2019-03-18
• 公開（公告）號: CN111705120A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 崔東紅;殷東敏
• 申請（專利權）人: 上海市精神衛生中心（上海市心理咨詢培訓中心）;華東師范大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6844
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開一種檢測人類MIF基因CATT重復序列純合子的試劑盒及步驟，該試劑盒由探針結合預混液、酶促反應預混液、信號放大預混液、純合子陽性對照品、陰性對照以及標準品組成。本發明含有MIF基因CATT5重復特異性結合環鎖探針的探針結合預混液、酶促反應預混液、信號檢測預混液、陰性標準品和陽性標準品，通過環鎖探針結合、酶促反應、等溫擴增信號放大，可區分MIF基因CATT五段重復序列純合子和非CATT五段重復序列雜合子，為精神分裂癥患者治療方案的用藥選擇提供了個性化的指導設計不依賴昂貴儀器、繁瑣操作的快速檢測試劑盒，避免非典型抗精神病藥物用藥副作用發生，首次實現精神疾病的個性化用藥和精準快速床旁檢測POCT。

技術領域

本發明涉及串聯重復序列檢測、等溫擴增等技術領域，尤其是涉及一種檢測人類MIF基因CATT重復序列純合子的試劑盒及步驟。

背景技術

非典型抗精神病藥物如處方藥奧氮平對精神分裂癥有顯著的療效，但部分巨噬細胞轉移抑制因子（MIF）高表達的基因表型患者用藥后會出現胰島素拮抗等代謝異常情況，而MIF低表達的基因表型（即MIF基因啟動子區域微衛星串聯重復序列CATT為五段重復的純合子基因型）的患者服用奧氮平后幾乎不產生副作用，MIF對藥物代謝具有重要的影響，因此決定MIF表達的MIF基因啟動子區域的微衛星CATT串聯重復序列可作為非典型抗精神病藥物用藥指導的生物靶標。

目前市面上檢測微衛星簡單串聯重復序列的方法主要是PCR結合毛細管電泳，先設計重復序列外圍兩端特異性結合的引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，再通過毛細管電泳精確確定擴增產物的長度和濃度比例，來區分基因型。也有基于熒光定量PCR平臺設計不同重復序列的特異性結合引物探針，每種引物用一種熒光標記，通過qPCR的熒光信號來確定基因型。兩種方法有較高的靈敏度和特異性檢測目的片段的基因型，但兩者都需要借助昂貴的儀器、復雜的操作來實現，而且對于雜合子檢測都會存在信號干擾的風險。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服上述背景技術中的技術問題，因此提供一種檢測人類MIF基因CATT重復序列純合子的試劑盒及步驟，從而解決上述問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種檢測人類MIF基因CATT重復序列純合子的試劑盒，其特征在于，該試劑盒由探針結合預混液、酶促反應預混液、信號放大預混液、純合子陽性對照品、陰性對照以及標準品組成；

所述探針結合預混液包括含有特異性識別MIF基因啟動子區域的帶有特定修飾的環鎖核酸探針、RecA蛋白、單鏈結合蛋白以及促進探針結合的緩沖液A；

所述酶促反應預混液包括能夠在室溫條件下反應且不具有3’-5’外切酶活性的聚合酶、在37 ℃下具有活性的高保真連接酶、四種隨機脫氧核糖核苷酸dNTP以及促進酶反應活性的緩沖液B；

所述信號放大預混液包括具有鏈置換活性的等溫擴增酶、鏈置換等溫擴增的引物、dNTP、結合雙鏈DNA的SYBR? Green熒光染料、促進酶反應活性的緩沖液C；

所述純合子陽性對照品為與探針結合預混液中環鎖核酸探針結合但不促進環鎖探針成環的合成DNA雙鏈片段；

所述陰性對照品為與探針結合預混液中環鎖核酸探針結合且促進環鎖探針成環的合成DNA雙鏈片段；

所述標準品為用于熒光計檢測的雙鏈DNA片段，有低濃度DNA和高濃度DNA兩管組分組。

作為本發明的一種優選技術方案，緩沖液A包括但不局限于Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP、EDTA和甘油，緩沖液A的pH為7.6。

作為本發明的一種優選技術方案，緩沖液B包括但不局限于Tris-HCl、醋酸鉀、醋酸鎂、NADⅠ型輔酶、DTT、Triton X-100和甘油，緩沖液B的pH為7.6。