[發明專利]檢測橡膠樹褐根病病菌的LAMP引物組合物及其應用

在審

• 申請號: 201910199701.5
• 申請日: 2019-03-15
• 公開（公告）號: CN109971878A
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 賀春萍;董文敏;吳偉懷;梁艷瓊;李銳;易克賢;謝立;黃興;習金根;鄭金龍;陸英
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/04;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京惟誠致遠知識產權代理事務所(普通合伙) 11536
• 代理人: 王慧鳳;李巍

本發明公開了一種檢測橡膠樹褐根病病菌的LAMP引物組合物及其應用。本發明的檢測橡膠樹褐根病病菌的LAMP引物組合物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成。基于該LAMP引物組合物建立的橡膠樹褐根病病菌可視化檢測方法，經過LAMP恒溫擴增后顯色反應或瓊脂糖凝膠電泳檢測，可觀察到綠色熒光或出現LAMP特征性的梯形條帶。本發明的LAMP引物組合物及其檢測方法能在田間實現橡膠樹褐根病病菌的快速、靈敏、準確檢測和鑒定，為橡膠樹褐根病的早期預警及防控提供可靠的技術手段和理論依據。

技術領域

本發明涉及農作物病害檢測鑒定技術和分子生物學技術領域，具體涉及一種用于檢測橡膠樹褐根病病菌(Phellinus noxius)的LAMP引物組合物、試劑盒和應用，可實現橡膠樹褐根病的早期診斷、病菌的監測和鑒定。

背景技術

天然橡膠是全球重要的工業原料和戰略物資，是國防工業和高端裝備生產中不可替代的重要原料，在我國主要分布于云南、海南、廣東、廣西、福建、臺灣等地區。我國天然橡膠的種植面積和產量均居世界第五位，也是全球最大的消費國和進口國。褐根病是橡膠生長中一種毀滅性的土傳病害，在世界各植膠區嚴重以及普遍發生，是限制我國橡膠單產提高的重要生物因子。該病害主要通過根系接觸傳染，染病植株因根部腐朽生長衰弱、樹葉變黃、枯萎脫落，從黃化到枯死通常僅需半月至三個月。對天然橡膠產業造成較大的經濟損失。

由有害層孔菌[Phellinus noxius(Corner)Corner G.H.Cunn.]引起的橡膠樹褐根病是天然橡膠生產中危害最為嚴重的根部病害，發生嚴重的林段發病率達10％以上，且死樹率高。褐根病發生早期不易被發現，待其出現病癥時，病菌危害已十分嚴重，防治十分困難。因此，建立快速、準確、靈敏、高效的檢測技術，及時檢測出樹體中的病原菌并采取科學有效的防治措施，對控制橡膠樹褐根病的傳播蔓延具有重要作用。

目前對橡膠樹褐根病菌的檢測以病癥識別及組織分離病原菌為主，但傳統方法往往專業性強、耗時長、靈敏度低，難以達到快速診斷和檢測的目的；利用分子生物學技術檢測該病病原菌方法有常規PCR方法(梁艷瓊等，2016)，雖然能夠快速、準確檢測出病原，但需要PCR儀、電泳和凝膠成像系統等昂貴的專業儀器設備和分子生物學專業的實驗人員操作，不適宜在基層以及田間大規模應用，使田間病情無法及時、準確的檢測及有效防控。

LAMP是一種在恒溫條件下，快速、高效、特異的擴增靶序列的核酸擴增技術(Notomi et al.,2000)，該技術在短時間內可實現大量擴增，60℃～65℃恒溫反應30min～60min內便能達到10⁹～10¹⁰倍的擴增，在反應產物中添加熒光染料通過顏色變化來判斷擴增結果，其特異性和靈敏性高，且不需要昂貴儀器設備，僅需在恒溫水浴鍋內即可完成，具有操作快速簡便、特異性強、靈敏度高、檢測成本低等特性。目前該技術已在植保等諸多領域得到廣泛應用，極大提高了鑒定效率和準確率。迄今，還未見應用LAMP技術對橡膠樹褐根病病原菌進行檢測的報道，因此建立高效、快速的橡膠樹褐根病菌LAMP檢測技術可為橡膠樹褐根病的發生和防治提供重要的技術手段。

發明內容

本發明的目的是克服傳統診斷方法的繁瑣、耗時長、準確度低和經驗要求高以及PCR檢測技術所需昂貴儀器設備、不便在田間直接檢測等問題，提供一種橡膠樹褐根病病菌LAMP檢測引物以及簡便、快捷、靈敏、特異的可視化檢測方法。

本發明另一目的在于提供上述快速檢測方法在橡膠樹褐根病的早期診斷、病菌的監測和鑒定中的應用。

本發明的第一方面提供了一種用于橡膠樹褐根病病菌LAMP快速檢測的引物組合物。

一種用于橡膠樹褐根病病菌(Phellinus noxius)LAMP快速檢測的引物組合物，由正向外引物F3、反向外引物B3、正向內引物FIP和反向內引物BIP組成，各引物核苷酸序列為：