[發明專利]檢測橡膠樹褐根病病菌的LAMP引物組合物及其應用

在審

• 申請號: 201910199701.5
• 申請日: 2019-03-15
• 公開（公告）號: CN109971878A
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 賀春萍;董文敏;吳偉懷;梁艷瓊;李銳;易克賢;謝立;黃興;習金根;鄭金龍;陸英
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/04;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京惟誠致遠知識產權代理事務所(普通合伙) 11536
• 代理人: 王慧鳳;李巍

1.檢測橡膠樹褐根病病菌(Phellinus noxius)的LAMP引物組合物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成。

2.一種檢測橡膠樹褐根病病菌(Phellinus noxius)的試劑盒，包括權利要求1所述的LAMP引物組合物。

3.根據權利要求2所示的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還包括PCR反應試劑。

4.一種橡膠樹褐根病病菌(Phellinus noxius)LAMP檢測方法，其特征在于：利用權利要求1所述的橡膠樹褐根病病菌LAMP引物組合物進行LAMP反應，LAMP反應體系為25μL，包括2.5μmol/L的序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA各2μL；20mmol/L的序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA各1.5μL；10mmol/L dNTPs 3.5μL；25mmol/L MgSO₄6μL；10mol/L甜菜堿2μL；10×Bst-DNA polymerase buffer 2.5μL；8U Bst 3.0 DNApolymerase 1μL；10～100ng/μL的DNA模板1μL；ddH₂O 2μL。

5.根據權利要求4所述的LAMP檢測方法，其特征在于：所述LAMP反應條件為60℃～65℃溫育60min，85℃滅活8min，終止反應。

6.一種橡膠樹褐根病病菌(Phellinus noxius)LAMP快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)提取待檢測樣品DNA；

(2)以提取的DNA為模板，利用權利要求1所述的LAMP引物組合物或權利要求2或3所述試劑盒進行LAMP擴增；

(3)LAMP擴增產物結果觀察，判定樣品DNA中是否含有橡膠樹褐根病病菌(Phellinusnoxius)，可通過3種方法進行判斷：1)通過肉眼直接觀察擴增產物顏色，是否有白色渾濁，若有白色渾濁則含有橡膠樹褐根病病菌(Phellinus noxius)，反之，則不含有；2)通過2％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，是否產生梯形條帶，若形成梯形條帶則含有橡膠樹褐根病病菌(Phellinus noxius)，反之則不含有；3)加入熒光顯色劑，觀察擴增產物是否變為綠色，若變為綠色則含有橡膠樹褐根病病菌(Phellinus noxius)，若擴增產物保持橙色，則不含有。

7.根據權利要求6所述的LAMP快速檢測方法，其特征在于，所述的熒光顯色劑為SYBRGreen I。

8.根據權利要求7所述的LAMP快速檢測方法，所述LAMP擴增按照權利要求4或5所述的LAMP檢測方法進行。

9.權利要求1所述的LAMP引物組以及權利要求2或3所述的試劑盒在檢測橡膠樹褐根病中的應用。

10.根據權利要求8所示的應用，其特征在于：所述檢測橡膠樹褐根病為橡膠樹褐根病的早期診斷、橡膠樹褐根病病菌的鑒定或橡膠樹褐根病病情監測。