[發明專利]一種促進人多能干細胞定向分化為內皮細胞的方法

有效

• 申請號: 201910197934.1
• 申請日: 2019-03-15
• 公開（公告）號: CN109797132B
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 胡士軍;雷偉;楊壯壯;趙振奧
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 馮瑞

本發明公開了一種促進人多能干細胞定向分化為內皮細胞的方法，本發明的方法包括：第0～1天，使用添加4～8μM的GSK3I的CDM3分化培養基對細胞密度達到95％以上的人多能干細胞進行誘導分化；第2天，使用添加40～60ng/ml bFGF的CDM3分化培養基對上一步誘導培養后的細胞進一步誘導分化；第3～5天，使用添加40～60ng/ml VEGF和20～30ng/ml BMP4的CDM3分化培養基對上一步誘導培養后的細胞進一步誘導分化；第6天對上一步誘導培養后的細胞進行消化，然后采用內皮細胞培養基繼續培養3～4天。本發明分化內皮細胞的方法更加的經濟有效，分化過程更加方便快捷；分化過程中不使用血清，排除多種因素的干擾，并且分化結果更可靠；且添加RA可以促進內皮分化的效率，一次分化可以得到更多的內皮細胞。

技術領域

本發明涉及一種促進人多能干細胞定向分化為內皮細胞的方法，屬于細胞培養技術領域。

背景技術

血管疾病影響數百萬人的健康。嚴重的血管疾病導致截肢和危及生命的中風。在所有血管腔內排列的內皮細胞在調節血管通透性，血管生成和組織再生起著至關重要的作用。在生理條件下，血管可以通過血管發生和血管生成產生。血管發生是指從祖細胞形成新血管，而血管生成是指通過現有血管細胞的遷移和增殖從現有血管形成新血管。然而，這些過程在患有中風，糖尿病或老年癡呆癥的患者中受到損傷。在血管疾病中，由于內皮細胞的異常病變或者死亡導致血管功能惡化，最近有研究表明，內皮細胞具有形成血管的能力，且對于改善血管疾病有很大的幫助，因此，需要獲得大量的人源的內皮細胞來治療這些血管疾病。

人多能干細胞，例如人胚胎干細胞(hESCs)和人誘導的多能干細胞(hiPSC)，能夠自我更新并分化成人體中的任何細胞類型，因此是產生內皮細胞(ECs)的理想資源。許多研究小組已經證明ECs可以來源于hiPSCs和hESCs。這些誘導得到內皮細胞可用于自體的缺血區域的血管重建和定制人造血管和組織,另外，體外利用多能干細胞分化內皮細胞也為研究調控內皮命運的分子機制提供了新的途徑。通過機制研究有助于理解血管疾病的發病機制以及為治療血管疾病提供有效的措施。然而，在開發臨床應用之前，必須建立從多能干細胞中獲得ECs的低成本且高效的方法。此外，需要進一步探索調控多能干細胞分化內皮細胞的機制。

目前分化內皮祖細胞的方法有很多種，但普遍存在分化的過程復雜，分化周期長，成本較高，分化不穩定等缺點。首先，在貼壁細胞分化方法中：2015年，GopμSriram等，使用StemDiff APEL，ECGM-MV2等分化培養基，連續添加BMP4、FGF2、VEGF的情況下，獲得CD31/CD144雙陽性的細胞比例為80.7％。但是此方法所用StemDiff APEL、ECGM-MV2分化培養基價格過高，使分化成本大大增加。2017年，Kit Man Tsang等，在連續七天的缺氧條件下，使用BMP4、FGF2、VEGF，使得內皮的分化效率由常氧下的12.4％提升為29.3％。在懸浮細胞分化的條件下，2010年，Hongkui Deng等，使用EB分化的方式，在七天的過程中，使用BMP4，VEGF的方法，獲得27％的CD34陽性的祖細胞。

目前，關于分化內皮細胞存在以下缺陷：成本過高，mTeSR培養基，StemDiff APEL，ECGM-MV2培養基價格過高，不適合大量培養和分化內皮細胞；現有技術分化效率低，得率低。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供一種促進人多能干細胞定向分化為內皮細胞的方法，本發明的方法降低了人胚胎干細胞H1系和人多能誘導干細胞體外誘導內皮細胞的成本，并進一步用視黃酸RA提高內皮細胞的分化效率，在一次分化過程中獲得更多的內皮細胞。

本發明的第一個目的是提供一種促進人多能干細胞定向分化為內皮細胞的方法，包括如下步驟：

(1)在第0～1天，使用添加4～8μM的GSK3I的CDM3分化培養基，對細胞密度達到95％以上的人多能干細胞進行誘導分化；