[發(fā)明專利]一種促進人多能干細胞定向分化為內(nèi)皮細胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910197934.1
• 申請日: 2019-03-15
• 公開（公告）號: CN109797132B
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡士軍;雷偉;楊壯壯;趙振奧
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 馮瑞

1.一種促進人多能干細胞定向分化為內(nèi)皮細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)在第0～1天，使用添加4～8μM GSK3I的CDM3分化培養(yǎng)基，對細胞密度達到95％以上的人多能干細胞進行誘導(dǎo)分化；

(2)在第2天，使用添加40～60ng/ml bFGF的CDM3分化培養(yǎng)基對步驟(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞進行進一步誘導(dǎo)分化；

(3)在第3～5天，使用添加40～60ng/ml VEGF和20～30ng/ml BMP4的CDM3分化培養(yǎng)基對步驟(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞進行進一步誘導(dǎo)分化；

(4)在第6天，添加細胞消化酶對步驟(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞進行消化，然后將消化后得到的細胞采用內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3～4天；

所述的CDM3分化培養(yǎng)基中含有RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、雙抗、牛血清白蛋白和抗壞血酸；

在步驟(2)中，在添加bFGF的同時加入0.8～1.2μM視黃酸；

所述的CDM3分化培養(yǎng)基中牛血清白蛋白的濃度為0.4～0.6mg/ml，抗壞血酸的濃度為0.20～0.25mg/ml，所述的雙抗為青霉素和鏈霉素，其中青霉素濃度為100U/ml，鏈霉素濃度為0.1mg/ml。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人多能干細胞為人胚胎干細胞H1系或人誘導(dǎo)的多能干細胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(1)之前，還包括采用干細胞培養(yǎng)基對人多能干細胞進行傳代培養(yǎng)至細胞密度達到95％以上。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的干細胞培養(yǎng)基為PSeasy-E8或mTeSR。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的傳代培養(yǎng)具體包括如下步驟：將人多能干細胞培養(yǎng)至細胞密度到達85～90％后，使用無鈣磷酸鹽緩沖液清洗細胞碎片，隨后加入0.5μM的EDTA，消化5～10min，然后將細胞吹散，吹散后按照1:6～1:10的比例傳代至Matrigel包被的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度為95％以上。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中，所述的GSK3I為CHIR99021。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細胞消化酶為胰酶細胞消化液或Accutase細胞消化液。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基為ECM培養(yǎng)基。