[發(fā)明專利]一種簡(jiǎn)單高效的單克隆抗體的純化方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910197627.3
• 申請(qǐng)日: 2019-03-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109762061A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李懷超;李雪嬌;張朔;曹啟江;張敏;唐琳;劉暢;周艷楠;趙洪禮;何向東;何偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 遼寧何氏醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C07K16/00
• 分類號(hào): C07K16/00;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18
• 代理公司: 沈陽(yáng)杰克知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

本發(fā)明涉及一種簡(jiǎn)單高效的單克隆抗體的純化方法，所述純化方法包括：對(duì)含有單克隆抗體的樣品進(jìn)行粗提純；對(duì)所述粗提純的產(chǎn)物進(jìn)行透析；利用HPLC法對(duì)所述透析的產(chǎn)物進(jìn)行純化，其中，所述純化采用陰離子交換介質(zhì)，以流動(dòng)相A和流動(dòng)相B為洗脫液，流速為1～3ml/min，利用梯度洗脫模式進(jìn)行洗脫，柱溫35～40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm；所述流動(dòng)相A為三羥甲基氨基甲烷緩沖液，所述流動(dòng)相B為三羥甲基氨基甲烷緩沖液和氯化鈉的混合溶液。本發(fā)明提供的單克隆抗體的純化方法簡(jiǎn)單易行，蛋白回收率高、重復(fù)性好，適用于批量制備單克隆抗體。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及單克隆抗體純化技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種方法簡(jiǎn)單、回收純度高的單克隆抗體的純化方法。

背景技術(shù)

單克隆抗體純化是單克隆抗體研究和單克隆抗體藥物制備過(guò)程中必須涉及和應(yīng)用的基本技術(shù)。常見(jiàn)的單克隆抗體純化通常是從細(xì)胞培養(yǎng)基中或者動(dòng)物腹水中純化藥物級(jí)單克隆抗體蛋白質(zhì)包括收獲和凈化，接著通過(guò)一系列的柱層析步驟或者膜超濾和滲濾結(jié)合而純化。在純化之后，期望的抗體制劑經(jīng)適當(dāng)配制并且存儲(chǔ)在合適的條件中。然而，在柱層析純化期間，有時(shí)可觀察到工藝相關(guān)的和產(chǎn)物相關(guān)的雜質(zhì)與期望的抗體一起共洗脫；同時(shí)，在各種柱層析聯(lián)用技術(shù)中往往會(huì)出現(xiàn)溶劑置換等問(wèn)題，不僅會(huì)打破蛋白在溶液中的穩(wěn)態(tài)環(huán)境，還可能導(dǎo)致蛋白失活變性，也會(huì)無(wú)形中增加了純化分析的難度與繁復(fù)程度，不利于商業(yè)化生產(chǎn)以及車間放大生產(chǎn)。因此，這種純化過(guò)程相對(duì)復(fù)雜、回收率比較低，且無(wú)法提供具有其藥物應(yīng)用所需的期望水平的純度和質(zhì)量的抗體。

此外，現(xiàn)有的抗體純化或者其他蛋白純化過(guò)程中經(jīng)常采用至少三種純化技術(shù)(例如，親和、離子交換、疏水相互作用等)相結(jié)合的方式使用來(lái)純化樣品，后期還要經(jīng)過(guò)超濾/微濾等滲透方法結(jié)束工藝步驟，然而，多種純化技術(shù)中的每一步純化都會(huì)造成目的蛋白的流失，嚴(yán)重影響收率，尤其是藥用領(lǐng)域的抗體類蛋白樣品，由于本身稀少難得，再經(jīng)過(guò)多步純化就會(huì)導(dǎo)致所剩無(wú)幾，還有可能因?yàn)榉睆?fù)的操作而造成其他的不良影響。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單高效的單克隆抗體的純化方法，該純化方法分離效果好、回收純度高。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種簡(jiǎn)單高效的單克隆抗體的純化方法，包括：對(duì)含有單克隆抗體的樣品進(jìn)行粗提純；對(duì)所述粗提純的產(chǎn)物進(jìn)行透析；利用HPLC法對(duì)所述透析的產(chǎn)物進(jìn)行純化，其中，所述純化采用陰離子交換介質(zhì)，以流動(dòng)相A和流動(dòng)相B為洗脫液，流速為1～3mL/min，利用梯度洗脫模式進(jìn)行洗脫，柱溫35～40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm；所述流動(dòng)相A為三羥甲基氨基甲烷緩沖液，所述流動(dòng)相B為三羥甲基氨基甲烷緩沖液和氯化鈉的混合溶液。

進(jìn)一步的，所述流動(dòng)相A的pH值為6.5～8.5；所述流動(dòng)相B的pH值為6.5～8.5。

進(jìn)一步的，所述三羥甲基氨基甲烷緩沖液的終濃度為10～50mmol/L；所述氯化鈉的終濃度為0.5～1mol/L。

進(jìn)一步的，所述含有單克隆抗體的樣品包括：含有單克隆抗體的小鼠腹水、含有單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清、重組單克隆抗體的發(fā)酵上清。

進(jìn)一步的，所述單克隆抗體包括：抗人CTGF單克隆抗體或抗人periostin單克隆抗體。

進(jìn)一步的，所述陰離子交換介質(zhì)是Q Sepharose FF系列、Capto Q系列、SOURCE Q系列、Propac-wax系列的陰離子交換凝膠。

進(jìn)一步的，選用長(zhǎng)度為20～30cm的色譜柱，填料粒徑為2～10μm。

進(jìn)一步的，對(duì)含有單克隆抗體的樣品進(jìn)行粗提純的步驟包括：基于鹽析法采用飽和硫酸銨溶液對(duì)含有單克隆抗體的樣品進(jìn)行鹽析。

更進(jìn)一步的，所述鹽析法包括：于含有單克隆抗體的樣品中先后加入飽和硫酸銨溶液至終濃度分別為體積百分濃度為40％～60％和30％～40％，分別于4℃鹽析2小時(shí)，離心。