[發(fā)明專利]一種改良嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910196890.0
• 申請日: 2019-03-15
• 公開（公告）號: CN109722420A
• 公開（公告）日: 2019-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張志杰;聶文冰;劉永軍;尹鴻萍
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇艾洛特醫(yī)藥研究院有限公司;江蘇艾洛特生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867
• 代理公司: 北京德崇智捷知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11467
• 代理人: 王斌

本發(fā)明涉及細(xì)胞免疫治療技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種改良嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備及其應(yīng)用；一種改良嵌合抗原受體T細(xì)胞，其特征在于所述T細(xì)胞在病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，將包括CAR在內(nèi)的三種慢病毒同時轉(zhuǎn)導(dǎo)入T細(xì)胞；對現(xiàn)有的CAR?T細(xì)胞進(jìn)行改造，同時將三種慢病毒共轉(zhuǎn)導(dǎo)入T細(xì)胞，一方面既可以發(fā)揮CAR對腫瘤的特異靶向作用，并對腫瘤進(jìn)行殺傷；另一方面，轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞的IL?7及IL?15因子同樣可促進(jìn)CAR?T細(xì)胞在體外的有效增殖，省去了實(shí)驗(yàn)過程中需多次加入IL?7及IL?15因子，簡化實(shí)驗(yàn)步驟，并可減少CAR?T制劑在制備過程中的成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞免疫治療技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種改良嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor)T細(xì)胞技術(shù)是不受免疫系統(tǒng)MHC的限制性，通過基因改造技術(shù)能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞特異靶向，從而對腫瘤進(jìn)行殺傷的一種發(fā)展迅速的細(xì)胞治療技術(shù)。自2017年FDA批準(zhǔn)了諾華公司的Tisagenlecleucel以及Kite的Axicabtegene Ciloleucel兩種CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品上市以來，其分別用于治療兒童和年輕人B細(xì)胞急性淋巴性白血病以及成人復(fù)發(fā)性或難治性大B細(xì)胞淋巴瘤，CAR-T免疫療法在針對血液瘤涉及急性B淋巴細(xì)胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤以及多發(fā)性骨髓瘤等的治療方面取得了顯著成效。并且美國醫(yī)保與醫(yī)助服務(wù)中心(Centers for Medicare and MedicaidServices,CMS)于2019年2月15日正式發(fā)布擬議決定備忘錄：批準(zhǔn)CAR-T細(xì)胞治療正式納入醫(yī)保。這使得CAR-T療法能夠更快速的運(yùn)用于臨床，為患者帶來福音。

據(jù)《2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)》顯示中國癌癥的發(fā)病人數(shù)及死亡人數(shù)均為世界第一。肺癌、乳腺癌以及結(jié)直腸癌為全球發(fā)病率最高的三種癌癥，而死亡率最高的則分別為肺癌、結(jié)直腸癌和胃癌。盡管CAR-T療法在血液瘤中取得顯著的進(jìn)展，而其針對實(shí)體瘤的治療特別是關(guān)于結(jié)直腸癌的治療仍有待解決。

為了獲得較好的臨床結(jié)果，確保CAR-T回輸制劑的質(zhì)量尤為重要，包括CAR-T制劑的細(xì)胞量、病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率等。這需要在體外培養(yǎng)過程中慢病毒能夠高效轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且細(xì)胞能夠有效的增殖。目前常用的促進(jìn)CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增的因子有IL-2或是IL-7/IL-15。在naive T細(xì)胞被激活后，效應(yīng)T細(xì)胞可分泌IL-2并且增加IL-2受體的表達(dá)，從而促進(jìn)T細(xì)胞的增殖。目前IL-2已經(jīng)是公認(rèn)的促進(jìn)T細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子。但是其本身對體內(nèi)存在的resting naiveT細(xì)胞及記憶T細(xì)胞的促增殖作用有限。IL-7可通過Jak-STAT通路及pI3K-AKt通路一方面抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活；另一方面誘導(dǎo)周期蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，從而促進(jìn)naive T細(xì)胞及記憶T細(xì)胞的增殖。IL-15與其受體結(jié)合后主要通過JAK1/STAT3、JAK3/STAT5以及Ras/MAPK三條信號通路發(fā)揮作用，通過增生信號的增強(qiáng)以及凋亡信號的減弱，從而增加CD8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

在CAR-T細(xì)胞制劑制備過程中，上述促進(jìn)細(xì)胞增殖的因子常常是額外添加至T細(xì)胞的培養(yǎng)體系中。而市售重組人源化的IL-7因子1mg售價在4680美元，重組人源化的IL-15因子1mg售價在4000美元左右，在T細(xì)胞培養(yǎng)過程中，需要多次加入相應(yīng)的因子，細(xì)胞因子的用量較大，極大提高了CAR-T細(xì)胞制備的成本，并且還需要確保不同批次細(xì)胞因子產(chǎn)品的質(zhì)量。CN109055430A公開了一種共表達(dá)IL-18和CCL19蛋白及靶向MUC1基因CAR-T細(xì)胞的制備方法。可以在CAR的設(shè)計過程中加入IL-18及CCL19基因，從而使CAR-T細(xì)胞共表達(dá)IL-18及CCL19因子，既可促進(jìn)T細(xì)胞增殖，也能募集更多的T細(xì)胞以及DC細(xì)胞至腫瘤組織一起殺傷腫瘤。盡管慢病毒載體能夠穩(wěn)定表達(dá)，但是其載體的容量小，最大只能容納約8Kb的目的基因。而目前在CAR的設(shè)計過程中，除了特異性識別腫瘤抗原的抗體外，還包括誘導(dǎo)CAR-T死亡的自殺基因等。若再額外加入多個基因，則可能會超過慢病毒載體的容量，影響病毒包裝。