[發(fā)明專利]共編輯標記ben-1 sgRNA靶位點及其CRISPR/Cas9共編輯系統(tǒng)和應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910196344.7
• 申請日: 2019-03-15
• 公開（公告）號: CN110066797A
• 公開（公告）日: 2019-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙培;康雅虹;黃河
• 申請（專利權(quán)）人: 福建上源生物科學技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;A01K67/033
• 代理公司: 福州市景弘專利代理事務所(普通合伙) 35219
• 代理人: 林祥翔;黃以琳

本發(fā)明為一種基于ben?1sgRNA靶位點的線蟲CRISPR/Cas9共編輯標記位點及其共編輯系統(tǒng)和應用，涉及線蟲基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說是一種利用ben?1sgRNA靶位點在線蟲中建立高效的CRISPR/Cas9共編輯系統(tǒng)及其在篩選目的編輯基因突變線蟲的方法，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：(1)彌補dyp?10等sgRNA靶位點，不宜對II號染色體上基因編輯進行共編輯標記的不足；(2)增加了線蟲CRISPR/Cas9共編輯系統(tǒng)中可使用的共編輯標記sgRNA位點的數(shù)量；(3)使用ben?1sgRNA做共編輯位點，被編輯后的線蟲跟野生型線蟲相比，生長更有優(yōu)勢，表型正常，便于挑選的同時，不影響生長狀態(tài)，有益于快速高效的完成研究，節(jié)省了時間。(4)使用ben?1sgRNA共編輯系統(tǒng)，與隨機篩選相比，篩選效率提高25倍以上，工作量減少到1/5，大大節(jié)約了篩選時間。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及線蟲基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說是一種利用ben-1基因的sgRNA靶位點在線蟲中建立高效的CRISPR/Cas9共編輯系統(tǒng)，以及使用這個系統(tǒng)高效篩選包含雜合或純合目的基因突變線蟲的應用方法。

背景技術(shù)

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans，以下簡稱線蟲)是一種以細菌為食，生活在土壤中，無毒無害、可以獨立生存的線蟲。它的特點有：(1)細胞數(shù)目固定，雌雄同體線蟲全身共有959個細胞，雄性線蟲全身共有1031個體細胞；(2)有雌雄同體和雄性兩種性別，既可以進行雜交又可以進行自交；(3)已完成了基因組測序；(4)生命周期短，25℃培養(yǎng)條件下整個生命周期僅為3天；(5)野生型線蟲胚胎發(fā)育中細胞分裂和細胞系的形成具有高度程序性，這樣就便于對其發(fā)育進行遺傳學分析；(6)繁殖能力強，成蟲一生可產(chǎn)300個受精卵；(7)易于保存，可以用-80℃冰箱長期保存。目前，線蟲作為一種經(jīng)典的遺傳學模式生物，由于具有生命周期短、基因組小、基因數(shù)目多、便于遺傳操作、通體透明易于顯微觀察等優(yōu)勢，被國內(nèi)外眾多的科研機構(gòu)作為研究材料，在RNAi、衰老、藥物篩選、功能基因組學等領(lǐng)域進行研究。研究發(fā)現(xiàn)，線蟲中大約有40-60％的基因是在人體中具有等同作用，并且有大量保守的人類遺傳疾病同源基因，所以，從理論上講，只要人類疾病的靶蛋白或調(diào)控途徑是物種間保守的，就可能利用該模式生物來進行研究。

2013年以來，從細菌免疫現(xiàn)象中發(fā)現(xiàn)和發(fā)展的CRISPR/Ca9基因編輯技術(shù)由于其構(gòu)造簡單、易于操控和改造以及價格低廉等優(yōu)勢，迅速成為基因編輯領(lǐng)域的主要研究技術(shù)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)最先于細菌中發(fā)現(xiàn)，是細菌抵御外界病毒感染的一種有效方式。CRISPR重復序列間有不同的間隔序列，表達出的RNA，可以通過堿基互補配對的方式指導Cas9蛋白特異地在外源入侵基因組上進行切割，從而阻斷外源基因組的復制從而達到低于外源DNA入侵的目的。

在線蟲的基因編輯中，CRISPR/Cas9共編輯系統(tǒng)是一種同時進行共編輯標記基因編輯和目的基因編輯的編輯系統(tǒng)。通常共編輯標記基因的編輯能產(chǎn)生易于識別的表型，收集這些發(fā)生了共編輯基因編輯的線蟲，再從中篩選目的基因編輯的效率比直接篩選高。