[發明專利]共編輯標記ben-1 sgRNA靶位點及其CRISPR/Cas9共編輯系統和應用

在審

• 申請號: 201910196344.7
• 申請日: 2019-03-15
• 公開（公告）號: CN110066797A
• 公開（公告）日: 2019-07-30
• 發明（設計）人: 趙培;康雅虹;黃河
• 申請（專利權）人: 福建上源生物科學技術有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;A01K67/033
• 代理公司: 福州市景弘專利代理事務所(普通合伙) 35219
• 代理人: 林祥翔;黃以琳

1.一種共編輯標記ben-1⁶⁴sgRNA靶位點，其特征在于，其靶DNA序列具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根據權利要求1所述的共編輯標記ben-1⁶⁴sgRNA靶位點，其脫靶效應位點為5’-N₂₀NGG-3’其特征在于，所述脫靶效應位點的靶DNA序列5’-N₂₀-3’中3’端的12bp靶DNA序列與所述ben-1⁶⁴sgRNA靶DNA序列不匹配的堿基個數至少為1個。

3.根據權利要求1所述的共編輯標記ben-1⁶⁴sgRNA靶位點，其特征在于，其編輯效率大于或等于10％。

4.根據權利要求1所述的共編輯標記ben-1⁶⁴sgRNA靶位點，其特征在于，特異識別所述ben-1⁶⁴sgRNA靶位點的sgRNA質粒具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

5.一種高效的線蟲CRISPR/Cas9共編輯系統，其特征在于，包含Cas9質粒、特異識別ben-1⁶⁴sgRNA靶位點的sgRNA質粒、特異識別目的編輯位點的sgRNA質粒、報告基因質粒、得到目的基因編輯所需的修復模板、雌雄同體線蟲、普通線蟲培養平板和濃度為14μMbenomyl的線蟲培養平板，所述ben-1⁶⁴sgRNA靶位點具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述特異識別ben-1⁶⁴sgRNA靶位點的sgRNA質粒具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

6.應用線蟲CRISPR/Cas9共編輯系統篩選雜合或純合目的基因編輯線蟲的方法，其特征在于，包括以下步驟：

備料：準備Cas9質粒、特異識別ben-1⁶⁴sgRNA靶位點的sgRNA質粒、特異識別目的編輯位點的sgRNA質粒、報告基因質粒、得到目的基因編輯所需的修復模板、雌雄同體線蟲、普通線蟲培養平板和濃度為14μM benomyl的線蟲培養平板，備用；

配制DNA混合液：將所述Cas9質粒、特異識別ben-1⁶⁴sgRNA靶位點的sgRNA質粒、特異識別目的編輯位點的sgRNA質粒、報告基因質粒和得到目的基因編輯所需的修復模板混合，得到DNA混合液；

顯微注射：將所述DNA混合液注射入雌雄同體線蟲的性腺，得到親本P0代線蟲，然后將所述P0代線蟲置于濃度為14μM benomyl的線蟲培養平板中培養，得到F1代線蟲；

挑選共編輯的F1代線蟲：從所述F1代線蟲中挑選出ben-1⁶⁴sgRNA靶位點被編輯的線蟲，其表型為生長良好、運動自如、運動軌跡如正弦曲線，將其單條置于所述普通線蟲培養平板中培養，得到F2代線蟲；

篩選具有目的基因突變共編輯的F1代線蟲的平板：將生長到L4及以上時期的所述F2代線蟲用線蟲裂解液進行裂解，得到F2代線蟲模板DNA，然后采用PCR擴增或酶切方法篩選出具有目的基因突變的線蟲，找到具有目的基因編輯和ben-1⁶⁴sgRNA靶位點共編輯的F1代線蟲平板；

去除ben-1⁶⁴sgRNA靶位點被編輯的線蟲：從所述具有目的基因突變的F1代共編輯線蟲的平板中挑選出8-16只F2代線蟲，分盤至濃度為14μM benomyl的線蟲培養平板，待F3代長至L4時期，篩選出不帶共編輯突變的線蟲平板，整盤線蟲表型都為身體癱瘓、短小、運動不協調；

篩選純合目的編輯的線蟲：將所述不帶共編輯突變線蟲平板中的線蟲制成DNA模板，通過分子生物學方法篩選出帶有純合目的基因突變的線蟲平板。

測序驗證純合目的基因突變線蟲是否正確。