[發明專利]一種基于RPA-側流層析技術檢測大豆疫霉的方法及其專用引物及探針組合

在審

• 申請號: 201910194830.5
• 申請日: 2019-03-14
• 公開（公告）號: CN109943624A
• 公開（公告）日: 2019-06-28
• 發明（設計）人: 戴婷婷;焦彬彬;胡濤;徐月;廖婷婷;田雯
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

本發明公開了一種基于RPA?側流層析技術檢測大豆疫霉的方法及其專用引物及探針組合，該方法包括1)提取待測樣本DNA；2)以DNA為模板，進行RPA擴增；3)應用側流層析試紙條進行擴增產物檢測；當試紙條出現兩條棕色條帶，一條位于質控區內，一條位于檢測區，則結果為陽性，表明樣本中含有大豆疫霉；當試紙條只有質控區出現一條棕色條帶，檢測區沒有條帶，則結果是陰性，表明樣本中不含有大豆疫霉。本發明所使用的引物探針組RPA擴增效果好，條帶特異性強，與其他病菌無交叉反應，在檢測區的有陽性反應，增加了檢測的靈敏性，為檢疫性疫霉菌的檢測提供了新的技術平臺，同時在病害侵染初期鑒定出病原物，能夠對出入境大豆中的大豆疫霉進行檢測。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及基于RPA-側流層析技術檢測大豆疫霉，專用于海關進出境大豆所帶大豆疫霉(Phytophthora sojae)的高靈敏度快速檢測，同時可用于田間大豆疫病的早期診斷和病菌的監測。具體涉及一種基于RPA-側流層析技術檢測大豆疫霉的方法及其專用引物及探針組合。

背景技術

大豆疫霉菌Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生產上的毀滅性病害之一，也是我國對外公布的一類檢疫對象。大豆疫霉根腐病最早于1948年在美國印第安那州被發現，此后，加拿大、巴西、阿根廷等二十多個大豆生產國家相繼報道了該病害的發生。蘇彥純等于1993年首次報道了我國的黑龍江大豆主產區發生大豆疫霉根腐病，此后在我國北方的大豆主產區陸續發現大豆疫霉的危害。目前每年給全球大豆生產造成的經濟損失超過10億美元。為了阻止大豆疫霉傳播范圍的不斷擴大，使大豆疫霉根腐病得到控制，需要對其進行快速、準確地檢測。

傳統的檢測大豆疫霉的方法是進行大豆葉碟誘捕和平板培養或者將二者相結合。傳統方法在大豆疫霉檢測中發揮了重要作用，但是費時費力而且要求操作者具備專業的疫霉分離、形態學鑒定知識和豐富的經驗。隨著核酸相關的鑒定方法的發展，基于PCR的方法已經成功用于檢測大豆疫霉，雖然PCR法在特異性和敏感性上有較大的提高，但是檢測時間仍然比較長，大概4～5h，同時PCR方法依賴精密的溫度循環裝置。其檢測靈敏度比較高，但是檢測過程復雜，不能滿足快速檢測的需求。

重組酶介導等溫擴增(Recombinase Polymerase Amlification，RPA)技術被公認是可以替代PCR的核酸檢測技術。其原理是利用重組酶與引物結合形成蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發生鏈交換反應形成并啟動DNA合成，對模板上的目標區域進行指數式擴增。另外，RPA技術有多重工具酶匹配進行有效擴增，擴增效率遠高于傳統的PCR技術，所用時間更短，最短可在5min內實現。由于RPA技術具有擴增用時短、不需昂貴儀器、特異性好等特點，使其應用越來越廣泛。RPA技術的最大特點是只需要1對引物即可在37℃左右的恒溫條件下實現模板核酸的擴增，不需要通過高低溫度循環實現核酸解鏈和退火，因此不需要昂貴的儀器設備。而且37℃的常規反應溫度很容易滿足，適合基層對病原菌的快速檢測。目前，RPA技術已經廣泛應用于人體、動物或植物上的病毒檢測，但在植物病原卵菌的檢測方面，尤其是對于檢疫性大豆疫霉的RPA檢測，未見相關應用報道。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種基于RPA-側流層析技術檢測大豆疫霉的方法，以建立大豆疫霉的快速檢測新方法。提供適用于所述檢測方法的檢測專用引物，以及含有該專用引物的試劑盒，是本發明的另一發明目的。

技術方案：為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：

一種基于RPA-側流層析技術檢測大豆疫霉的方法，包括以下步驟：

1)提取待測樣本DNA；