[發明專利]一種基于RPA-側流層析技術檢測大豆疫霉的方法及其專用引物及探針組合

在審

• 申請號: 201910194830.5
• 申請日: 2019-03-14
• 公開（公告）號: CN109943624A
• 公開（公告）日: 2019-06-28
• 發明（設計）人: 戴婷婷;焦彬彬;胡濤;徐月;廖婷婷;田雯
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

1.一種基于RPA-側流層析技術檢測大豆疫霉的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)提取待測樣本DNA；

2)以DNA為模板，進行RPA擴增；其中，正向引物為RPA-PSYPT-F：5'-GCCCTCTCGAGCGGACGCTTTAGAGTCCAGGATG-3'；反向引物為RPA-PSYPT-R：5’-[Biotin]AGAATACCAATAATCAGAAGCGTACACCCACCAG-3’；探針為PSYPT-P：5’-[FAM]TTCCGATCCAGTTGCTGACAATATTGTGCC[dSpacer]GTTGTCCCGCCCAGA[C3-spacer]-3’；

3)應用側流層析試紙條進行擴增產物檢測；當試紙條出現兩條棕色條帶，一條位于質控區內，一條位于檢測區，則結果為陽性，表明樣本中含有大豆疫霉；當試紙條只有質控區出現一條棕色條帶，檢測區沒有條帶，則結果是陰性，表明樣本中不含有大豆疫霉。

2.根據權利要求1所述的基于RPA-側流層析技術檢測大豆疫霉的方法，其特征在于，步驟2)中，RPA擴增：向裝有檢測干粉的反應單元管中加入緩沖液Buffer 29.5μL，10μM的上游引物2.1μL，10μM的下游引物2.1μL，探針0.6μL，DNA 2.0μL；MgAc 2.5μL加在八連管的蓋子上，共計50μL擴增體系，小心翻轉蓋上，將RPA擴增體系充分混勻，5,000×g離心10s，置于39℃金屬浴上反應30min，溫育4分鐘后拿出反應管再次混勻，離心3-5秒，放入水浴鍋繼續反應30min。

3.一種基于RPA-側流層析技術檢測大豆疫霉的專用引物和探針組合，其特征在于，具體如下：

引物序列為：

RPA-PSYPT-F：5'-GCCCTCTCGAGCGGACGCTTTAGAGTCCAGGATG-3'；

RPA-PSYPT-R：5’-[Biotin]AGAATACCAATAATCAGAAGCGTACACCCACCAG-3’；

探針序列為：

PSYPT-P：5’-[FAM]TTCCGATCCAGTTGCTGACAATATTGTGCC[dSpacer]GTTGTCCCGCCCAGA[C3-spacer]-3’。

4.權利要求3所述的引物和探針組合在檢測大豆疫霉中的應用。

5.一種基于RPA-側流層析技術檢測大豆疫霉的試劑盒，其特征在于，至少包括1次用量以上的權利要求3所述的專用引物和探針組合試劑。

6.根據權利要求5所述的基于RPA-側流層析技術檢測大豆疫霉的試劑盒，其特征在于，正向引物和反向引物終濃度均為0.42μmol/L，探針的終濃度為0.12μmol/L。

7.根據權利要求5所述的基于RPA-側流層析技術檢測大豆疫霉的試劑盒，其特征在于，還包括：標準陽性DNA、緩沖液、酶擴增八聯管、無菌雙蒸水、反應驅動液、產物稀釋液和側流層析試紙條。

8.根據權利要求5所述的基于RPA-側流層析技術檢測大豆疫霉的試劑盒，其特征在于，每50μL擴增體系中含有緩沖液29.5μL、大豆疫霉RPA相應的引物探針液4.7μL、無菌雙蒸水11.2μL、待測樣本DNA為陽性對照分別為2μL或以無菌雙蒸水為空白對照2μL、反應驅動液2.5μL。