[發明專利]絲狀支原體絲狀亞種P35脂蛋白及其在診斷牛傳染性胸膜肺炎中的應用

有效

• 申請號: 201910194597.0
• 申請日: 2019-03-14
• 公開（公告）號: CN109970844B
• 公開（公告）日: 2022-08-23
• 發明（設計）人: 辛九慶;李媛
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所（中國動物衛生與流行病學中心哈爾濱分中心）
• 主分類號: C07K14/30
• 分類號: C07K14/30;C12N15/31;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

本發明公開了一種絲狀支原體絲狀亞種P35脂蛋白及其在診斷牛傳染性胸膜肺炎中的應用。本發明通過篩選獲得了一個免疫原性良好的Mmm脂蛋白，命名為P35，實驗證明，rP35蛋白能夠與CBPP陽性血清發生反應且與牛源性其他3種常見支原體感染樣品血清不發生交叉反應，具有良好的特異性。此外，本發明還提出了一種用于診斷牛傳染性胸膜肺炎的試劑盒，并建立了基于該試劑盒的ELISA檢測方法，并對反應進行條件優化，確定了其cut off值。經過ELISA實驗證明，本發明建立的ELISA檢測方法具有良好的特異性、敏感性以及重復性，能夠用于牛傳染性胸膜肺炎高效、快速的診斷。本發明的提出為牛傳染性胸膜肺炎的診斷提供了新的技術手段。

技術領域

本發明涉及一種絲狀支原體絲狀亞種脂蛋白及其在檢測絲狀支原體絲狀亞種以及診斷牛傳染性胸膜肺炎中的應用。本發明屬于醫藥技術領域。

背景技術

牛傳染性胸膜肺炎(contagious bovine pleuropneumonia,CBPP)是由絲狀支原體絲狀亞種(Mycoplasma mycoides subsp.Mycoides Small Colony,Mmm)感染引起牛的一種烈性傳染疾病。該病被OIE規定為必需要報道的疾病。上世紀50-70年代我國曾爆發嚴重的CBPP，造成了巨大的經濟損失，哈爾濱獸醫研究所的獸醫工作者經過長期艱苦卓越的斗爭消滅了該病，2011年，經OIE認可我國為無牛傳染性胸膜肺炎(簡稱“牛肺疫”)國家。成為世界上第七個無牛肺疫的國家。我國雖已消滅了CBPP，但是周邊國家都是發病國家，對于牛群監測，防止疫病的發生仍責任重大。本實驗室作為牛傳染性胸膜肺炎國家參考實驗室，每年會對該病進行全國范圍的監測，并且一直致力與CBPP診斷試劑的研發工作。

有效的診斷技術對于控制CBPP起著至關重要的作用。控制CBPP最重要的一點是建立一個高效的Mmm的檢測方法，要求該方法能同時檢測到發病牛群和亞臨床感染牛群體內攜帶的Mmm。在診斷CBPP技術方面，金標準依然是病原分離，此方法耗時耗力且需要配備專業實驗室以及專業人員進行。并且培養物還需要PCR確認，PCR檢測方法雖然靈敏性和特異性較好，但需要專業設備和專業人員操作，不適用于大范圍的檢測樣本。ELISA方法因其高敏感性、強特異性及短時間內檢測大量樣品的特點成為研究的重點，已被廣泛應用于實驗室檢測。目前國際認可的血清學技術為OIE推薦的補體結合反應(CFT)和競爭性酶聯免疫吸附試驗(cELISA)，CFT有其自身的缺陷，敏感性并不高，cELISA僅用于流行病學調查，cELISA試劑盒價格昂貴，且完全依賴進口，受制于他人，目前國內未見有CBPP的ELISA試劑盒。

本發明利用生物信息分析選定CBPP其中的一個脂蛋白P35，然后用基因重組技術，在體外通過原核表達系統得到大量重組蛋白并利用Ni-柱進行純化，以該純化后的重組蛋白作為包被抗原,建立初步的間接ELISA方法，以此來鑒定此重組蛋白的免疫源性，為牛傳染性胸膜肺炎血清學方法的建立、疫苗的研制提供了新的技術手段。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能夠高效、準確檢測絲狀支原體絲狀亞種(Mycoplasma mycoides subsp.Mycoides Small Colony,Mmm)的方法。

為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段：