[發(fā)明專利]一種多聚酶法快速免疫組化試劑盒及其免疫組化方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910193338.6 | 申請日： | 2019-03-14 |
| 公開（公告）號： | CN109781983A | 公開（公告）日： | 2019-05-21 |
| 發(fā)明（設計）人： | 熊雨勝;張薇;郭高升;趙婷婷;周歡 | 申請（專利權）人： | 武漢原谷生物科技有限責任公司 |
| 主分類號： | G01N33/573 | 分類號： | G01N33/573 |
| 代理公司： | 上海精晟知識產(chǎn)權代理有限公司 31253 | 代理人： | 馮子玲 |
| 地址： | 430000 湖北省武漢市東湖新技術開發(fā)區(qū)高新大*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 免疫組化 多聚體 試劑盒 二抗 酶法 免疫組化試劑盒 快速免疫組化 蘇木素復染液 信號放大系統(tǒng) 結合物溶液 反應系統(tǒng) 非特異性 分子結合 疾病研究 快速檢測 臨床診斷 結合物 染色 級聯(lián) 抗體 術后 一抗 聚合 放大 科學研究 節(jié)約 | ||
1.一種多聚酶法免疫組化試劑盒，其特征在于，包括濃度為10-20μg/mL的多聚酶HRP標記抗體結合物溶液、DAB顯色液和蘇木素復染液。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種多聚酶法免疫組化試劑盒，其特征在于，所述多聚酶HRP標記抗體結合物溶液濃度為10-20μg/mL。
3.根據(jù)權利要求1或2任一所述的一種多聚酶法免疫組化試劑盒，其特征在于，所述多聚酶HRP標記抗體結合物溶液是采用抗體稀釋液稀釋多聚酶HRP標記抗體結合物制備而成；所述抗體稀釋液包括5g/L的酪蛋白、1g/L的牛血清蛋白、質量濃度為0.1％的吐溫20、質量濃度為0.04％的Proclin300。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種多聚酶法免疫組化試劑盒，其特征在于，所述多聚酶HRP標記抗體結合物的制備方法為：
1)氧化反應：取8mg辣根過氧化物酶，加8mmol NaIO4，反應20分鐘，得到含醛基的HRP；
2)聚合形成多聚酶：步驟1)得到的含醛基的HRP中加入2ml質量濃度為3％的非離子表面活性劑，再用1M Na2CO3-NaHCO3溶液調(diào)pH至8.8-9.2，然后4℃旋轉反應過夜得多聚酶；所述的非離子表面活性劑為TritonX-100；
3)純化：步驟2)得到的多聚酶用10mM磷酸鹽生理緩沖液透析換液3次，得透析物；
4)連接一抗：取出步驟3)得到的透析物，加入適用于臨床診斷的抗體；用10μl濃度為1M的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液調(diào)pH至8.3-8.7，旋轉反應4小時；
5)還原穩(wěn)定化：加入120μl濃度為5mg/ml NaHB4，搖勻，室溫靜置還原90分鐘；
6)純化：10mM磷酸鹽生理緩沖液透析，換液3次，取出透析物，得多聚酶HRP標記抗體結合物。
5.一種基于權利要求1-4任一所述多聚酶法免疫組化試劑盒的快速免疫組化方法，其特征在于，包括如下步驟：
(1)取新鮮組織冰凍切片；
(2)組織切片固定，晾干，PBS沖洗；
(3)抗體孵育：滴加多聚酶HRP標記抗體結合物溶液，孵育2-6min后用PBS沖洗；所述多聚酶HRP標記抗體結合物溶液濃度為10-20μg/mL；
(4)滴加DAB顯色2-5min后，PBS沖洗；
(5)蘇木精染色2-3min，水洗后封固。
6.根據(jù)權利要求5所述的一種快速免疫組化方法，其特征在于，所述步驟(3)中抗體孵育時間為3-4min。
7.一種基于權利要求1-4任一所述多聚酶法免疫組化試劑盒的免疫組化方法，其特征在于，包括如下步驟：
1)石蠟切片脫蠟-水化-修復/冰切固定；
2)3％H2O2阻斷13-18min，PBST/TBST沖洗3*5min；
3)孵育多聚酶標記抗體37℃25-35min，PBST/TBST沖洗3*5min；
4)滴加DAB顯色2-5min后，PBS沖洗30s；
5)蘇木精染色2-3min，藍化液返藍；
6)脫水-透明-封片。
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