[發明專利]一種多聚酶法快速免疫組化試劑盒及其免疫組化方法

在審

• 申請號: 201910193338.6
• 申請日: 2019-03-14
• 公開（公告）號: CN109781983A
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: 熊雨勝;張薇;郭高升;趙婷婷;周歡
• 申請（專利權）人: 武漢原谷生物科技有限責任公司
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

本發明涉及一種多聚酶法免疫組化試劑盒及其免疫組化方法，該試劑盒包括濃度為10?20μg/mL的多聚酶HRP標記抗體結合物溶液、DAB顯色液和蘇木素復染液。本發明的免疫組化方法基于多聚酶技術，采用多個HRP分子聚合成HPR多聚體作為此方法的信號放大系統，采用HRP多聚體與多個一抗分子結合，形成抗體?HRP結合物作為此方法的反應系統，達到信號放大的效果，無需級聯放大。該方法減少了使用二抗的步驟，節約大量時間，同時避免了因二抗產生的非特異性染色。該方法同時滿足術中快速檢測和術后的臨床診斷、疾病研究、指導用藥及科學研究等。

技術領域

本發明屬于生物醫學技術領域，更具體地，涉及一種多聚酶法快速免疫組化試劑盒及其免疫組化方法。

背景技術

免疫組化用標記的特異性抗體對組織切片或細胞標本中某些化學成分的分布和含量進行組織和細胞原位定性、定位或定量研究的技術，廣泛用于臨床病理診斷，鑒別診斷、疾病研究、組織學、細胞學等科學研究領域及其他需要免疫組化的領域。

現將其使用領域按照要求分為兩類，一類要求在極短時間10-15min得到結果，例如：在術中診斷，常用術中診斷技術為組織化學(HE),但是其容易出現假性判斷及對微小癌、初期癌癥診斷誤判率較高，這時就需要借助免疫組化進行鑒別、輔助外科醫師判斷病變性質、決定手術方式；另一類針對類似臨床診斷、組織、細胞、疾病研究等領域長期需要處理大量切片、涂片，需要簡化實驗步驟，減少實驗時間，提高效率同時對組化結果要求較高，例如：在臨床診斷中隨著腫瘤的發病率持續增長，由于病理醫生較缺乏，工作量大，病理結果的實效性，都要求免疫組化可以實現簡單快捷高效的模式。

傳統的免疫組化反應時間長、需要8-20h，步驟多，操作較為繁瑣，容易產生非特異性染色，無法在術中快速簡單準確的完成疾病診斷，也很難為病理醫生及生命科學領域的科研人員提供及時的疾病信息和科學數據。

發明內容

針對現有技術中存在的技術問題，本發明提出了一種多聚酶法快速免疫組化試劑盒及其免疫組化方法，該方法利用HRP多聚體直接與多個一抗分子結合，反應只需一步即可完成，顯著提高反應速率，減少操作步驟、定位更準確、特異性更高，大幅減少實驗時間，為病理醫生提供及時準確的疾病信息，避免HE染色出現的假陽性或假陰性以及傳統的免疫組化耗時長，貽誤病情。

為實現上述目的，本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明的第一個目的在于提出一種多聚酶法免疫組化試劑盒，包括濃度為10-20μg/mL的多聚酶HRP標記抗體結合物溶液、DAB顯色液和蘇木素復染液。

進一步地，所述多聚酶HRP標記抗體結合物溶液濃度為10-20μg/mL。

更進一步地，所述多聚酶HRP標記抗體結合物溶液是采用抗體稀釋液稀釋多聚酶HRP標記抗體結合物制備而成；所述抗體稀釋液包括5g/L的酪蛋白、1g/L的牛血清蛋白、質量濃度為0.1％的吐溫20、質量濃度為0.04％的Proclin300。

進一步地，所述多聚酶HRP標記抗體結合物的制備方法為：

1)氧化反應：取8mg辣根過氧化物酶，加8mmol NaIO4，反應20分鐘，得到含醛基的HRP；

2)聚合形成多聚酶：步驟1)得到的含醛基的HRP中加入2ml質量濃度為3％的非離子表面活性劑，再用1M Na2CO3-NaHCO3溶液調pH至8.8-9.2，然后4℃旋轉反應過夜得多聚酶；所述的非離子表面活性劑為TritonX-100；

3)純化：步驟2)得到的多聚酶用10mM磷酸鹽生理緩沖液透析換液3次，得透析物；

4)連接一抗：取出步驟3)得到的透析物，加入適用于臨床診斷的抗體；用10μl濃度為1M的Na₂CO₃-NaHCO₃緩沖溶液調pH至8.3-8.7，旋轉反應4小時；