[發明專利]基于Taqman-MGB探針的基因多態性檢測方法及檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201910190919.4
• 申請日: 2019-03-14
• 公開（公告）號: CN109811043A
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發明（設計）人: 郭海榮;王穎;李品;鄧海洋
• 申請（專利權）人: 武漢明德生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 黃君軍

本發明提供了一種基于Taqman?MGB探針法的基因多態性檢測方法及檢測試劑盒，該方法包括：(1)人工合成含有待測位點的野生型和突變型序列的質粒DNA，并制備待測位點各基因型參考品；(2)配制待測位點的PCR反應液，體系內包含一對擴增引物及野生型探針、突變型探針；(3)采用待測位點PCR反應液檢測各基因型參考品，設置基線、閾值后分析得到Ct_野生型和Ct_突變型，其中基線設為6～18或手動調整，閾值取各熒光通道熒光增量的5％～50％；(4)計算ΔCt值＝Ct_突變型?Ct_野生型；(5)采用所述ΔCt值判斷被測多態性位點基因型。該方法能快速靈敏地檢測基因多態性，且采用ΔCt值作分型分析可避免分型錯誤。

技術領域

本發明涉及遺傳基因檢測技術領域，尤其涉及一種基于Taqman-MGB探針的基因多態性檢測方法及檢測試劑盒。

背景技術

單核苷酸多態性(single nucleotidepolymorphism，SNP)是主要指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，即指基因組內特定核苷酸位置上,存在兩種不同的核苷酸。SNP是人類可遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態性的90％以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計其總數可達300萬個甚至更多，是繼微衛星之后的第三代遺傳標記。一般情況下，SNP位點只有兩種堿基組成，是一種二態標記，即二等位基因(biallelic)。具有單核苷酸多態性的基因有很多，例如：(1)人CYP2C19基因具有遺傳多樣性，CYP2C19*2(G681A)與CYP2C19*3(G636A)是中國人群中最常見的遺傳變異類型，可造成酶活性喪失，導致人群出現快代謝(EM)、中間代謝(IM)及慢代謝(PM)三種表型。研究表明，CYP2C19參與氯吡格雷活性代謝產物和中間代謝產物的形成。氯吡格雷活性代謝物的藥代動力學和抗血小板作用隨著CYP2C19基因型的不同而有差異。CYP2C19慢代謝型(PM)患者應用常規劑量的氯吡格雷后體內活性代謝物生產減少，對血小板的抑制作用下降。人CYP2C19基因多態性檢測可為臨床提供氯吡格雷用藥參考。(2)人MTHFR基因具有遺傳多樣性，C677T與A1298C是最常見的多態性位點，引起酶分子熱穩定性和活性下降。MTHFR基因編碼的亞甲基四氫葉酸還原酶是同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)代謝過程中的關鍵酶，催化5,10-亞甲基四氫葉酸為5-甲基四氫葉酸，后者提供甲基給Hcy合成甲硫氨酸和四氫葉酸。研究表明，MTHFR酶活性降低是血Hcy水平升高的原因之一，而血Hcy水平升高則是心腦血管事件的獨立危險因素，與心腦血管事件風險呈正相關。(3)人ALDH2基因具有遺傳多樣性。中國人群中，ALDH2基因最常見的多態性位點為G1510A，又稱ALDH2*2；攜帶ALDH2*2突變等位基因的個體酶活性大幅下降，雜合子個體酶活性僅為野生型個體的10％，突變純合子個體酶活性缺失。ALDH2基因編碼的線粒體乙醛脫氫酶是抗心絞痛急性發作藥物硝酸甘油的重要代謝酶，可將硝酸甘油代謝為具有藥理活性的一氧化氮。研究表明，攜帶ALDH2*2等位基因的個體代謝硝酸甘油的能力下降，硝酸甘油抗心肌缺血的效應減弱。國家衛生計生委醫政醫管局印發的《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南(試行)》中指出：攜帶ALDH2*2等位基因的心絞痛患者應盡可能改用其他急救藥物，避免硝酸甘油含服無效。

SNP研究是人類基因組計劃走向應用的重要步驟，它為生物學的基礎研究提供了一個強有力的工具。目前，SNP已應用于遺傳圖譜繪制的標記、疾病診斷和疾病易感基因的鑒別、藥物基因組學研究和新藥篩選、藥物代謝和藥物遺傳學、法醫鑒定和個體識別、群體遺傳學研究和遺傳多態性分析、物種鑒定、菌種鑒定等。另外，通過對Y染色體SNP的分析，使得在人類進化、人類種群的演化和遷徙領域取得了一系列重要成果。