[發(fā)明專利]基于Taqman-MGB探針的基因多態(tài)性檢測方法及檢測試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910190919.4
• 申請日: 2019-03-14
• 公開（公告）號(hào): CN109811043A
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭海榮;王穎;李品;鄧海洋
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢明德生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6858
• 分類號(hào): C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 武漢智嘉聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 42231
• 代理人: 黃君軍

1.一種基于Taqman-MGB探針的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

步驟1、人工合成含有目標(biāo)基因被測多態(tài)性位點(diǎn)的野生型和突變型目標(biāo)序列的質(zhì)粒DNA，并制備被測多態(tài)性位點(diǎn)各基因型參考品；或使用不同基因型人基因組DNA制備各基因型參考品；

步驟2、配制待測基因多態(tài)性位點(diǎn)的PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括檢測目標(biāo)基因待測多態(tài)性位點(diǎn)的上、下游引物，及目標(biāo)基因的待測多態(tài)性位點(diǎn)的突變型探針和野生型探針，突變型采用FAM或VIC/HEX標(biāo)記，野生型采用VIC/HEX或FAM標(biāo)記；

步驟3、應(yīng)用被測位點(diǎn)PCR反應(yīng)液檢測各基因型參考品，設(shè)置基線、閾值后分析得到Ct_野生型和Ct_突變型，其中基線設(shè)為6～18或手動(dòng)調(diào)整，閾值取各熒光通道熒光增量的5％～50％；

步驟4、計(jì)算ΔCt值＝Ct_突變型-Ct_野生型；

步驟5、根據(jù)所述ΔCt值判斷基因型，判斷標(biāo)準(zhǔn)為：

a、當(dāng)ΔCt值＞4時(shí)，該待測基因的被測多態(tài)性位點(diǎn)為野生型；

b、-3＜ΔCt值＜3時(shí)，該待測基因的被測多態(tài)性位點(diǎn)為雜合型；

c、ΔCt值＜-4時(shí)，該待測基因的被測多態(tài)性位點(diǎn)為突變型。

2.如權(quán)利要求1所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液還包括5×TaqMan-MGB Genotyping Master Mix。

3.如權(quán)利要求1所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于，所述待測基因的被測多態(tài)性位點(diǎn)包括人CYP2C19基因的G681A和G636A兩個(gè)SNP位點(diǎn)；人MTHFR基因的C677T和A1298C兩個(gè)SNP位點(diǎn)；人ALDH2基因的G1510A位點(diǎn)。

4.如權(quán)利要求1所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于，所述步驟3中熒光PCR擴(kuò)增檢測的反應(yīng)條件為：37℃ 5min；95℃ 2min；95℃ 10S，60℃ 40秒，循環(huán)45次。

5.一種采用權(quán)利要求1-4任一所述的基因多態(tài)性檢測方法的基因多態(tài)性檢測試劑盒。

6.如權(quán)利要求5所述的基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括人CYP2C19基因的多態(tài)性檢測試劑盒，包括如下兩對引物及其對應(yīng)的探針：

(1)用于人CYP2C19基因G681A SNP位點(diǎn)檢測的引物和探針：

上游引物CYP2C19 681F：5’-GATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTG-3’

下游引物CYP2C19 681R：5’-CTCCAAAATATCACTTTCCATAAAAGC-3’

突變探針CYP2C19 681A：5’FAM-TATTTCCCAGGAACC-3’MGB；

野生探針CYP2C19 681G：5’VIC-TATTTCCCGGGAACC-3’MGB；

(2)用于人CYP2C19基因G636A SNP位點(diǎn)檢測的引物和探針：

上游引物CYP2C19 636F：5’-GATGGAAAAATTGAATGAAAACATCA-3’

下游引物CYP2C19 636R：5’-GTGGTTTCTCAGGAAGCAAAAAAC-3’

突變探針CYP2C19 636A：5’FAM-CACCCCCTGGATC-3’MGB；

野生探針CYP2C19 636G：5’VIC-CACCCCCTGAATC-3’MGB。