[發(fā)明專利]一種檢測肺炎鏈球菌的RCA方法

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• 申請日: 2019-03-13
• 公開（公告）號: CN109797233A
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發(fā)明（設計）人: 朱世新;朱玉華;石康
• 申請（專利權）人: 湖北朗德醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12R1/46
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務所 42103
• 代理人: 成鋼

本發(fā)明公開了一種檢測肺炎鏈球菌的RCA方法，按照如下步驟完成：（1）標本DNA的提取；（2）捕獲探針的雜交，（3）鎖式探針的環(huán)化連接與酶切，（4）RCA擴增，再用瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像儀觀察電泳結果。本發(fā)明鎖式探針結合RCA技術是一種檢測肺炎鏈球菌的新方法，通過鎖式探針特異識別靶基因序列，RCA擴增放大檢測信號。該方法不需特殊設備、操作簡單、特異性好、靈敏度高，在細菌檢測方面具有獨特優(yōu)勢。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地說，涉及一種檢測肺炎鏈球菌的RCA方法。

背景技術

肺炎鏈球菌于1881年首次由巴斯德(Louis Pasteur)及G.M.Sternberg分別在法國及美國從患者痰液中分離出。為革蘭染色陽性，菌體似矛頭狀，成雙或成短鏈狀排列的雙球菌，有毒株菌體外有化學成分為多糖的莢膜。5％～10％正常人上呼吸道中攜帶此菌。有毒株是引起人類疾病的重要病原菌。

在化膿性球菌中，肺炎鏈球菌的致病力僅次于金黃色葡萄球菌。不同的是，到目前為止，肺炎鏈球菌極少對青霉素類抗生素產(chǎn)生耐藥性。肺炎球菌主要的致病物質(zhì)是肺炎球菌溶血素及莢膜。莢膜具有抗原性，是肺炎鏈球菌分型的依據(jù)。此菌可引起大葉性肺炎、腦膜炎、支氣管炎等疾病。主要引起大葉性肺炎，成人中75％由1,2,3,4,5,7,8,9,12型引起，半數(shù)以上為1,2,3型.3型產(chǎn)生大量莢膜物質(zhì)，毒力強，病死率高.兒童以第6,14,19及23型肺炎鏈球菌感染最常見.可繼發(fā)胸膜炎，膿胸，中耳炎，腦膜炎和敗血癥等。肺炎鏈球菌在正常人的口腔及鼻咽部經(jīng)常存在，一般不致病，只形成帶菌狀態(tài).只有在免疫力下降時才致病.尤其在呼吸道病毒感染后或嬰幼兒，年老體弱者易發(fā)生肺部感染。感染后，可建立較牢固的型特異性免疫.其免疫機制主要是產(chǎn)生莢膜多糖型特異抗體，起調(diào)理作用，增強吞噬功能。肺炎鏈球菌也可侵入機體其它部位，引起繼發(fā)性胸膜炎、中耳炎、乳突炎、心內(nèi)膜炎及化膿性腦膜炎等。

針對肺炎鏈球菌的檢查方法有很多，包括涂片染色鏡檢、莢膜染色、分離培養(yǎng)、小鼠毒力試驗和PCR法等，但是目前針對肺炎鏈球菌的檢測方法主要還是涂片染色和PCR檢測，涂片染色方法的特異性和靈敏性不高，常常造成假陽性結果；PCR方法靈敏度高、特異性強，但反應條件要求高，并且也存在一定的假陽性反應。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種檢測肺炎鏈球菌的RCA方法，該檢測方法操作簡單、檢測時間周期短、高特異性和靈敏性，通過滾環(huán)復制法，能夠檢測出肺炎鏈球菌。

本發(fā)明的技術方案如下：一種檢測肺炎鏈球菌的RCA方法，按照如下步驟完成：

(1)將待測標本按Qiagen公司的細菌DNA提取試劑盒步驟處理，獲得含肺炎鏈球菌的基因組DNA樣品；

(2)捕獲探針的雜交：在反應管中依次加入含肺炎鏈球菌的基因組DNA樣品、鎖式探針、捕獲探針，充分混勻，55±1℃水浴雜交0.5-1.5h，緩慢冷卻至室溫，加入溶于2×結合緩沖液中的鏈霉親和素包被的磁珠(2×:2倍工作濃度的結合緩沖液，鏈霉親和素包被的磁珠購自上海生物工程有限公司，下同)，混勻，室溫放置20-25min，磁性分離。用1×結合緩沖液清洗磁珠2次(1×:1倍工作濃度的結合緩沖液，下同)，棄去洗液。(雜交意義：將待檢測的病毒靶基因從病毒基因組中分離出來，提高檢測效率和準確度)