[發明專利]一種檢測肺炎鏈球菌的RCA方法

在審

• 申請號: 201910190537.1
• 申請日: 2019-03-13
• 公開（公告）號: CN109797233A
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發明（設計）人: 朱世新;朱玉華;石康
• 申請（專利權）人: 湖北朗德醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12R1/46
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務所 42103
• 代理人: 成鋼

1.一種檢測肺炎鏈球菌的RCA方法，其特征在于，按照如下步驟完成：

(1)將待測標本按Qiagen公司的細菌DNA提取試劑盒步驟處理，獲得含肺炎鏈球菌的基因組DNA樣品；

(2)捕獲探針的雜交：在反應管中依次加入含肺炎鏈球菌的基因組DNA樣品、鎖式探針、捕獲探針，充分混勻，55±1℃水浴雜交，雜交完成后自然冷卻至室溫，加入溶于2×結合緩沖液的鏈霉親和素包被的磁珠，混勻，室溫放置，磁性分離，用1×結合緩沖液清洗磁珠數次，棄去洗液，得到雜交產物；

(3)鎖式探針的環化連接與酶切：去離子水、步驟(2)制得的雜交產物和10×E.coliBuffer，輕輕混勻，在95±1℃下反應3-5min，然后再在45±1℃下孵育后，加入10×BSA緩沖液和E.coli DNA連接酶，混勻，在37±1℃進行環化連接反應；反應完成后加入10×Exonuclease Ⅰ Buffer和Exonuclease Ⅰ核酸外切酶，混勻，在37±1℃反應，反應完成后在95±1℃下條件下滅活Exonuclease Ⅰ核酸外切酶，得到探針環化連接產物；

(4)RCA擴增：取步驟(3)中制得的探針環化連接產物、加入引物和10×phi29 Buffer，混勻后在95±1℃下反應3-5min，然后進行冰浴；再加入phi29DNA聚合酶、dNTPs液，混勻后在37±1℃進行RCA反應，得到擴增產物；

(5)取步驟(4)制得的擴增產物用的瓊脂糖凝膠電泳，有肉眼可見條帶擴增出來的為肺炎鏈球菌陽性，反之為肺炎鏈球菌陰性，即可完成對肺炎鏈球菌的檢測；

所述步驟(4)中所設計用于RCA反應的引物是：

5’-CATACTCTATTAGTATTATAATGTGCTCGATCGACAGCTTATA-3’ SEQ NO1；

所述步驟(2)中的鎖式探針為：

5’-TGCCTTTCAATGCAGATAAGTATCTAGAGGATAAACGAGGTAGACGAAGCAATTACCGCCCGGAACCAACAGGGACAACACCATAGGCAATTCTCCTTATTCC-3’探針的5’端進行磷酸化修飾 SEQ NO2；

所述步驟(2)中的捕獲探針為：

Biotin-CATACTCTATTAGTATTATCTTAGCCCAAAACATGTAAGTCCCACCACACTTAT SEQ NO3。

2.根據權利要求1所述的檢測肺炎鏈球菌的RCA方法，其特征在于，步驟(2)中鎖式探針、捕獲探針的濃度均為0.5-1.5μmol/L，且鎖式探針、捕獲探針相對于DNA樣品體積的10-20％。

3.根據權利要求1所述的檢測肺炎鏈球菌的RCA方法，其特征在于，步驟(3)中10×E.coli Buffer相對于步驟(2)制得的雜交產物體積的18-25％；10×BSA緩沖液相對于步驟(2)制得的雜交產物體積的18-25％；E.coli DNA連接酶相對于步驟(2)制得的雜交產物體積的1.5-2.5％；10×Exonuclease I Buffer相對于步驟(2)制得的雜交產物體積的18-25％；Exonuclease I相對于步驟(2)制得的雜交產物體積的18-25％。

4.根據權利要求1所述的檢測肺炎鏈球菌的RCA方法，其特征在于，步驟(4)中引物的添加量為探針環化連接產物的1.8-3％；10×phi29 Buffer的添加量為探針環化連接產物的9.5-15％；phi29 DNA聚合酶的添加量為探針環化連接產物的1.8-3％。