[發(fā)明專利]用于預(yù)防弓形蟲感染的RH:Δtkl1減毒活疫苗及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910187582.1
• 申請(qǐng)日: 2019-03-13
• 公開（公告）號(hào): CN109999189A
• 公開（公告）日: 2019-07-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王金磊;梁勤立;侯俊玲;白夢(mèng)捷;朱興全
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): A61K39/002
• 分類號(hào): A61K39/002;A61P33/02;C12N15/113;C12N15/90;C12N1/11
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發(fā)明公開了一種用于預(yù)防弓形蟲感染的RH:Δtkl1減毒活疫苗，該減毒活疫苗的制備方法是構(gòu)建質(zhì)粒pSAG1::Cas9::U6sgTKL1和DHFR抗性片段，然后構(gòu)建弓形蟲RH:Δtkl1蟲株，以PBS作為溶劑在細(xì)胞培養(yǎng)基中制成弓形蟲弱毒蟲株RH:Δtkl1的速殖子混懸液。本發(fā)明確立了該減毒活疫苗的免疫劑型，探明了其免疫接種程序及劑量，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明制備的減毒活疫苗對(duì)于弓形蟲急性感染、慢性感染及先天性感染均具有良好的免疫保護(hù)作用，可有效預(yù)防弓形蟲病。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于弓形蟲減毒活疫苗技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于預(yù)防弓形蟲感染的RH:Δtkl1減毒活疫苗及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)簡(jiǎn)稱弓形蟲，是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的機(jī)會(huì)性致病原蟲，可感染包括人在內(nèi)的幾乎所有的溫血?jiǎng)游铮谑澜绶秶鷥?nèi)廣泛分布。免疫缺損者感染弓形蟲后可引起宿主嚴(yán)重的腦病、眼病、流產(chǎn)、畸胎或死胎等，嚴(yán)重危害人類的健康，并給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

研究表明，弓形蟲在中間宿主體內(nèi)存在速殖子和緩殖子2種形態(tài)，而現(xiàn)有藥物的治療僅對(duì)蟲體的速殖子時(shí)期起作用，對(duì)于包囊內(nèi)的緩殖子收效甚微，且藥物的使用存在一定的毒副作用。于是，對(duì)于弓形蟲病的防控轉(zhuǎn)向疫苗免疫宿主的開發(fā)研究，但因靶標(biāo)基因?qū)ふ依щy，目前為止尚無有效疫苗可用于弓形蟲病的防控。

目前研發(fā)較為集中的滅活疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗等弓形蟲病疫苗，其對(duì)免疫機(jī)體僅能提供部分免疫保護(hù)力，不能完全保護(hù)，免疫保護(hù)效果并不理想。因此，弓形蟲病疫苗的研發(fā)轉(zhuǎn)向了免疫原性好、免疫期長(zhǎng)的弱毒疫苗。而目前僅有一株S48弓形蟲弱毒活疫苗被允許在預(yù)防山羊和綿羊的流產(chǎn)中應(yīng)用，因此研究出更多的弓形蟲弱毒疫苗以擴(kuò)大其應(yīng)用范圍是目前弓形蟲病疫苗研究的重要目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述背景技術(shù)中指出的現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防弓形蟲感染的RH:Δtkl1減毒活疫苗及其制備方法，所制備的減毒活疫苗能夠有效抵抗弓形蟲的急性感染、慢性感染和先天性感染，可用于預(yù)防弓形蟲病。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種用于預(yù)防弓形蟲感染的RH:Δtkl1減毒活疫苗，該減毒活疫苗是以PBS作為溶劑制成的弓形蟲弱毒蟲株RH:Δtkl1的速殖子混懸液。

上述用于預(yù)防弓形蟲感染的RH:Δtkl1減毒活疫苗的制備方法如下：

(1)敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)弓形蟲TKL1基因設(shè)計(jì)sgRNA：GCCTCAGACTGCCAAAGGGA，然后將pSAG1::Cas9::U6sgUPRT中的sgRNA替換成TKL1，即構(gòu)建質(zhì)粒pSAG1::Cas9::U6sgTKL1；從質(zhì)粒pUPRT-DHFR-D擴(kuò)增獲得DHFR抗性片段；

(2)弓形蟲蟲株RH:Δtkl1的構(gòu)建

培養(yǎng)速殖子用于弓形蟲的電轉(zhuǎn)染，將所述質(zhì)粒pSAG1::Cas9::U6sgTKL1與DHFR抗性片段電轉(zhuǎn)到弓形蟲中，獲得弓形蟲單克隆蟲株，放大培養(yǎng)后，提取基因組DNA，驗(yàn)證TKL1基因是否敲掉，PCR擴(kuò)不出來者為陽性RH:Δtkl1蟲株；

(3)減毒活疫苗的制備

含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基中加入100μL RH:Δtkl1蟲株，培養(yǎng)并收集RH:Δtkl1速殖子，過濾細(xì)胞碎片，然后用無菌PBS調(diào)整速殖子的濃度。

優(yōu)選地，所述DHFR抗性片段擴(kuò)增的引物為：

DHFR-F：AAGCTTCGCCAGGCTGTAAA；

DHFR-R：GGAATTCATCCTGCAAGTGC。

優(yōu)選地，驗(yàn)證TKL1基因是否敲掉時(shí)，所用引物為：