[發明專利]用于預防弓形蟲感染的RH:Δtkl1減毒活疫苗及其制備方法和應用在審
| 申請號： | 201910187582.1 | 申請日： | 2019-03-13 |
| 公開（公告）號： | CN109999189A | 公開（公告）日： | 2019-07-12 |
| 發明（設計）人： | 王金磊;梁勤立;侯俊玲;白夢捷;朱興全 | 申請（專利權）人： | 中國農業科學院蘭州獸醫研究所 |
| 主分類號： | A61K39/002 | 分類號： | A61K39/002;A61P33/02;C12N15/113;C12N15/90;C12N1/11 |
| 代理公司： | 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350 | 代理人： | 湯東鳳 |
| 地址： | 730046 甘肅*** | 國省代碼： | 甘肅;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 減毒活疫苗 弓形蟲 弓形蟲感染 制備 制備方法和應用 免疫保護作用 免疫接種程序 細胞培養基 先天性感染 動物實驗 弓形蟲病 構建質粒 急性感染 抗性片段 慢性感染 有效預防 毒蟲 混懸液 溶劑 構建 預防 發現 | ||
1.一種用于預防弓形蟲感染的RH:Δtkl1減毒活疫苗，其特征在于，所述減毒活疫苗是以PBS作為溶劑制成的弓形蟲弱毒蟲株RH:Δtkl11的速殖子混懸液。
2.如權利要求1所述的用于預防弓形蟲感染的RH:Δtkl11減毒活疫苗的制備方法，其特征在于，所述制備方法如下：
(1)敲除質粒的構建
根據弓形蟲TKL1基因設計sgRNA：GATGAAGGTGCAAGCTCCCG，然后將pSAG1::Cas9::U6sgUPRT中的sgRNA替換成TKL1，即構建質粒pSAG1::Cas9::U6sgTKL1；從質粒pUPRT-DHFR-D擴增獲得DHFR抗性片段；
(2)弓形蟲RH:Δtkl11蟲株的構建
培養速殖子用于弓形蟲的電轉染，將所述質粒pSAG1::Cas9::U6sgTKL1與DHFR抗性片段電轉到弓形蟲中，獲得弓形蟲單克隆蟲株，放大培養后，提取基因組DNA，驗證TKL1基因是否敲掉，PCR擴不出來者為陽性RH:Δtkl11蟲株；
(3)減毒活疫苗的制備
含FBS的DMEM培養基中加入100μL RH:Δtkl11蟲株，培養并收集RH:Δtkl11速殖子，過濾細胞碎片，然后用無菌PBS調整速殖子的濃度。
3.如權利要求2所述的用于預防弓形蟲感染的RH:Δtkl11減毒活疫苗的制備方法，其特征在于，所述DHFR抗性片段擴增的引物為：
DHFR-F：AAGCTTCGCCAGGCTGTAAA；
DHFR-R：GGAATTCATCCTGCAAGTGC。
4.如權利要求2所述的用于預防弓形蟲感染的RH:Δtkl11減毒活疫苗的制備方法，其特征在于，驗證TKL1基因是否敲掉時，所用引物為：
KO-TKL1-F:GATTTGTCGCATGTGCCATCT；
KO-TKL1-R：CGCACTTGCATGAATTTACCA。
5.如權利要求2所述的用于預防弓形蟲感染的RH:Δtkl11減毒活疫苗的制備方法，其特征在于，所述速殖子的濃度為106個/200μL。
6.如權利要求1所述的用于預防弓形蟲感染的RH:Δtkl11減毒活疫苗應用于急性弓形蟲感染的免疫保護。
7.如權利要求1所述的用于預防弓形蟲感染的RH:Δtkl11減毒活疫苗應用于慢性弓形蟲感染的免疫保護。
8.如權利要求1所述的用于預防弓形蟲感染的RH:Δtkl11減毒活疫苗應用于先天性弓形蟲感染的免疫保護。
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