[發明專利]一種血漿中曲司氯銨的定量檢測方法

在審

• 申請號: 201910185419.1
• 申請日: 2019-03-12
• 公開（公告）號: CN109884205A
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發明（設計）人: 李高;張媛
• 申請（專利權）人: 康誠科瑞醫藥研發（武漢）有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 成都頂峰專利事務所(普通合伙) 51224
• 代理人: 陳夏

1.一種血漿中曲司氯銨的定量檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)標準工作溶液的配制：稱取曲司氯銨至玻璃瓶中，加入甲醇，配制成濃度為1～10mg·mL^-1的曲司氯銨儲備液，分別將所述曲司氯銨儲備液用體積比為1:1的甲醇水溶液稀釋成多個曲司氯銨工作溶液，多個曲司氯銨工作溶液的濃度各不相同；稱取曲司氯銨-d8至玻璃瓶中，加入甲醇配制成濃度為1～10mg·mL^-1的內標儲備液，用體積比為1:1的甲醇水溶液稀釋成濃度為10～20ng·mL^-1的內標工作溶液；曲司氯銨工作溶液及內標工作溶液均在-20℃下保存，備用；

(2)待測血漿樣品前處理過程：取待測血漿樣品，向待測血漿樣品中加入步驟(1)的內標工作溶液，然后加入乙腈沉淀劑，渦旋混合，離心取上清液并向上清液中加入純化水，振蕩混勻，進行液相色譜串聯質譜/質譜測定，得待測血漿樣品對應的曲司氯銨和曲司氯銨-d8的色譜圖；

(3)標準曲線的制作：等量取步驟(1)的多個曲司氯銨工作溶液，分別加入到空白血漿樣品中，然后加入步驟(1)的內標工作溶液，再加入乙腈沉淀劑，渦旋混勻，離心取上清液并向上清液中加入純化水，振蕩混勻，分別得多個曲司氯銨校正標準溶液，進行液相色譜串聯質譜/質譜測定，得一系列具有不同已知濃度的曲司氯銨校正標準溶液的色譜圖，以曲司氯銨和曲司氯銨-d8的色譜峰面積比為縱坐標，以曲司氯銨的血藥濃度與曲司氯銨-d8的血藥濃度的比值為橫坐標，采用加權最小二乘法進行線性回歸制作標準曲線，得回歸方程Y＝a+bX；

(4)待測血漿樣品中的曲司氯銨的血藥濃度的計算：根據回歸方程計算待測血漿樣品中的曲司氯銨的血藥濃度。

2.根據權利要求1所述的血漿中曲司氯銨的定量檢測方法，其特征在于：步驟(2)中的離心條件為：離心溫度為4℃，離心速度為4000rpm，離心時間為10min。

3.根據權利要求1所述的血漿中曲司氯銨的定量檢測方法，其特征在于：按照步驟(1)中的曲司氯銨儲備液的配制方式，平行配制另一份曲司氯銨儲備液，將另一份曲司氯銨儲備液分別稀釋成濃度為300、200、20和3ng·mL^-1的曲司氯銨工作溶液，分別加入到空白血漿樣品中，然后加入步驟(1)的內標工作溶液，再加入乙腈沉淀劑，渦旋混勻，離心取上清液并向上清液中加入純化水，振蕩混勻，分別得四個質控樣品，進行液相色譜串聯質譜/質譜測定，得四個質控樣品的色譜圖。

4.根據權利要求1所述的血漿中曲司氯銨的定量檢測方法，其特征在于：液相色譜串聯質譜/質譜測定過程的工作條件為：

a.液相色譜條件：2.1×50mm的色譜柱；流動相A為0.1％甲酸和2mM乙酸銨的水溶液；流動相B為乙腈；柱溫為30～50℃；流速為0.2～0.8mL/min；洗脫方式為梯度洗脫；

b.質譜條件：離子源為ESI源，采用正離子模式及多反應監測模式；電噴霧電壓為4500～5500V；渦旋離子噴霧溫度為500～600℃；氣簾氣的壓力為30psi；霧化氣的壓力為50psi；輔助氣的壓力為55psi；數據收集時間為3～5min。

5.根據權利要求4所述的血漿中曲司氯銨的定量檢測方法，其特征在于：所述液相色譜條件還包括：自動進樣器的清洗溶液為50％的甲醇水溶液；自動進樣器的溫度為8℃；自動進樣器的清洗模式為進樣前清洗和進樣后清洗；自動進樣器的洗針體積為500μL；自動進樣器進樣針清洗時的浸泡時間為1s；自動進樣器的進樣體積為20μL。

6.根據權利要求5所述的血漿中曲司氯銨的定量檢測方法，其特征在于：曲司氯銨在質譜條件中對應的監測離子對為392.0/164.2，去簇電壓為60V，碰撞能量為45eV。

7.根據權利要求6所述的血漿中曲司氯銨的定量檢測方法，其特征在于：曲司氯銨-d8在質譜條件中對應的監測離子對為400.0/172.2，去簇電壓為60V，碰撞能量為45eV。

8.根據權利要求1-7任一項所述的血漿中曲司氯銨的定量檢測方法，其特征在于：步驟(3)中的曲司氯銨校正標準溶液的數量為8～10個，曲司氯銨校正標準溶液的濃度為0.05～20ng·mL^-1。