[發明專利]一種用于檢測D型流感病毒D/660分支的熒光定量PCR檢測材料及試劑盒

在審

• 申請號: 201910184009.5
• 申請日: 2019-03-12
• 公開（公告）號: CN109929948A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 羅開健;張奇;馮賽祥;孫海亮;王曉冰;柳子巍;謝嘉渠;施建鑫
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

本發明公開了一種用于檢測D型流感病毒D/660分支的熒光定量PCR檢測材料及試劑盒，材料中包括包括qPCR前引物、qPCR后引物和特異性熒光定量探針，其中，qPCR前引物序列為：GCAAAGAAGTTTCGGTCATTGTC；qPCR后引物序列為：CCAGTTTACCCCTTCATAAAATA；特異性熒光定量探針序列為：熒光基團?AAAAGCCGACAACATCAACGAAGC?淬滅基團。經驗證表明使用本發明中的引物和特異性熒光探針結合本發明中提供的方法，可以實現對D型流感病毒的D/660分支的高特異性的定量檢測。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，更具體地，涉及一種用于檢測D型流感病毒D/660分支的熒光定量PCR檢測材料及試劑盒。

背景技術

流感病毒是一種嚴重威脅人、畜健康的傳染病。IDV是一種單股負鏈RNA病毒，具有7個基因組片段，編碼9種蛋白質：糖蛋白血凝素-酯酶融合蛋白(HE)；聚合酶PB2，PB1和P3；核蛋白；基質蛋白(M1和CM2)，和非結構蛋白(NS1和NEP)。IDV與ICV有低于50％的蛋白質序列同一性。IDV與人ICV產生的血清之間沒有交叉反應。在2014年國際病毒分類委員會執委會批準命名了一種新病毒—D型流感病毒，提議為正粘病毒科的新成員。

2011年IDV首次從患有呼吸道疾病的豬中分離出，隨后在美國、法國、日本、中國、愛爾蘭等多個地區都有所報道。D型流感病毒分為兩個分支D/OK和D/660，若能確定是屬于D型流感病毒的哪個分支，能夠及時的預防治療，減少經濟損失。血清學研究表明至少從2004年以來IDV存在于肉牛中。犢牛的母體抗體水平在6個月后降低，剛斷奶的犢牛似乎最容易感染。牛被認為是IDV的天然宿主。研究表明雞和火雞沒有感染IDV，但是來自人血清樣本的血清學證據發現，人的血清能檢測到陽性，所以IDV可能具有潛在的公共健康風險。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種迅速準確，能極大縮短檢測周期的用于檢測D型流感病毒D/660分支的熒光定量PCR材料。

本發明另一要解決的技術問題是提供一種用于檢測D型流感病毒D/660分支的熒光定量PCR檢測試劑盒。

本發明還一要解決的技術問題是提供上述熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測方法。

本發明的目的通過以下技術方案予以實現：

提供一種用于檢測D型流感病毒D/660分支的熒光定量PCR材料，包括qPCR前引物、qPCR后引物和特異性熒光定量探針，

qPCR前引物序列為：

GCAAAGAAGTTTCGGTCATTGTC(SEQ ID NO.1)

qPCR后引物序列為：

CCAGTTTACCCCTTCATAAAATA(SEQ ID NO.2)

特異性熒光定量探針序列為：

熒光基團-AAAAGCCGACAACATCAACGAAGC-淬滅基團(SEQ ID NO.3)

優選地，所述特異性熒光定量探針的熒光基團為FAM熒光基團；所述猝滅基團為BHQ1淬滅基團。

提供一種用于檢測D型流感病毒D/660分支的熒光定量PCR檢測試劑盒，包括反轉錄酶與抑制劑、熒光定量PCR酶混合液，陽性對照樣品、陰性對照樣品和ddH₂O，其中熒光定量PCR酶混合液中包括上述的熒光定量PCR檢測材料。

優選地，所述qPCR前引物、qPCR后引物的濃度為10μmol/L，所述特異性熒光定量探針的濃度為10μmol/L。

進一步地，所述陽性對照為含有所述qPCR前引物與所述qPCR后引物擴增片段的18-T載體質粒溶液。