[發(fā)明專利]C4植物葉肉細(xì)胞、維管束鞘細(xì)胞的類囊體膜的分離提取方法

在審

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• 申請日: 2019-03-11
• 公開（公告）號: CN109722409A
• 公開（公告）日: 2019-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林雪喬;劉明媚;李秀秀;秦曉春
• 申請（專利權(quán)）人: 濟(jì)南大學(xué)
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 李桂存

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了設(shè)計(jì)出了一種C₄植物的葉肉細(xì)胞與維管束鞘細(xì)胞的類囊體膜的分離提取方法，通過破壁機(jī)的不同檔位的機(jī)械作用，分別得到葉肉細(xì)胞及維管束鞘細(xì)胞的類囊體膜，該工藝簡單，容易操作。采用本工藝提取類囊體膜，提取時間短，且與酶解法相比，本發(fā)明的工藝簡單，提取時間短，且處理量大，最后通過本發(fā)明可以分別得到葉肉細(xì)胞的類囊體膜及維管束鞘細(xì)胞的類囊體膜，從而獲得需要的蛋白等。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種C₄植物的葉肉細(xì)胞與維管束鞘細(xì)胞的類囊體膜的分離提取方法。

背景技術(shù)

光合作用是地球上最大規(guī)模的能量和物質(zhì)轉(zhuǎn)換過程，是幾乎一切生命生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)。光合作用分成兩個過程。第一個過程是在類囊體膜上，太陽光激發(fā)光合電子傳遞系統(tǒng)中的葉綠素吸收太陽光，把光能轉(zhuǎn)化成化學(xué)能，生成能量分子ATP和NADPH，這個過程叫光反應(yīng)。第二個過程叫暗反應(yīng)，在酶的催化下，消耗ATP提供的能量和NADPH，將二氧化碳和水合成碳水化合物。

根據(jù)固碳方式的不同可以將植物分為碳三植物（C₃植物），如小麥、大豆、水稻、煙草、棉花等；碳四植物（C₄植物），例如玉米、甘蔗、高粱等。碳三植物固碳效率低，碳四植物中有一種特殊的花環(huán)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)特征將光合作用反應(yīng)分在兩種不同類型的細(xì)胞內(nèi)，葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞，維管束鞘細(xì)胞環(huán)繞維管組織，與此同時，一個外部的葉肉細(xì)胞環(huán)包繞維管束并與細(xì)胞間隙相鄰。C₄植物把用于碳固定和碳還原的細(xì)胞分開的類囊體膜結(jié)構(gòu)對于二氧化碳的吸收和高效的進(jìn)行光合作用是十分必要的。

葉綠體是植物及某些高等藻類進(jìn)行光合作用的主要場所。植物葉綠體內(nèi)部由基質(zhì)和類囊體組成，基質(zhì)是光合作用暗反應(yīng)的場所，類囊體是光合作用光反應(yīng)的場所，是光捕獲、光合電子傳遞、質(zhì)子易位及 ATP 合成的位點(diǎn)，因此大部分與光合作用有關(guān)的蛋白質(zhì)和蛋白復(fù)合物均定位于類囊體膜及類囊體腔中，類囊體膜系統(tǒng)主要包括四種高豐度的多亞基膜蛋白復(fù)合體，即 PSI、PSII、Cytb6f及ATP合酶。葉綠體類囊體膜中的蛋白質(zhì)復(fù)合體是植物進(jìn)行光能吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵部位，因而一直是光合作用研究的熱點(diǎn)。隨著膜蛋白提取分離效率的提高，在此基礎(chǔ)上研究類囊體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能將有助于我們更深入地了解葉綠體類囊體的功能及其代謝規(guī)律。

現(xiàn)階段葉肉細(xì)胞與維管束鞘細(xì)胞的分離提取工藝大多為酶解法，該工藝耗時長、且費(fèi)用消耗大。采用酶解法一般是將葉片小條放入含有纖維素酶、果膠酶的緩沖液，使細(xì)胞壁酶解。酶解下來的細(xì)胞再通過濾、漲破、離心等操作得到類囊體膜。但是酶解法通常需要較長的時間的酶解反應(yīng)才能得到原生質(zhì)體，而且隨著需要得到類囊體膜的量的增加，酶的使用量也會隨之增大，費(fèi)用也會增大。酶解法對于一些成熟的葉片酶解的時候效果也不是很好。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)階段類囊體膜分離存在的問題，本發(fā)明提供了設(shè)計(jì)出了一種C₄植物的葉肉細(xì)胞與維管束鞘細(xì)胞的類囊體膜的分離提取方法，該方法操作簡單、成本低，且可大量快速純化。

一種C₄植物葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞的類囊體膜的分離提取方法，包括以下步驟：

（1）取C₄植物的葉片，清洗后擦掉水分，去掉葉片中間的葉脈，將葉片剪成0.5-1cm小條；

（2）取剪碎的葉片放入在冰箱提前預(yù)冷的破壁機(jī)，加入預(yù)冷后的搗碎液，破碎至葉片外層的葉肉細(xì)胞80-90％掉落；

（3）低溫過濾，搗碎液涮洗破壁機(jī)，再過濾，合并濾液，即為葉肉細(xì)胞；

（4）將步驟（3）的濾渣加入預(yù)冷后的搗碎液，繼續(xù)破碎至葉肉細(xì)胞95%及以上掉落；過濾，留濾渣，棄濾液；

（5）將步驟（4）的濾渣加入預(yù)冷后的搗碎液，破碎至維管束鞘細(xì)胞90-99%及以上掉落，過濾，濾液即為維管束鞘細(xì)胞；